Катионообменники предварительная обработка

Ионообменная хроматография заключается в ионном обмене между полимером, заполнившим колонку, и заряженным белком, пропускаемым через колонку. Различают два типа ионообменников. Катионообменник — КМ-целлюлоза — это полимер целлюлозы, к которой по ОН-группе пришита карбоксиметильная группа. Подготовка смолы к работе — пропускание через нее 0,5М NaOH. В результате образуется солевая форма с катионами N3+. Затем пропускаем через колонку катионы белка. Они вытесняют На и занимают его место. Прочность связи (электростатической) зависит от величины положительного заряда, т.е. числа ионизированных ННз" -групп. Анионообменник — ОЕЛЕ-целлюлоза. Предварительная обработка анионообменника щелочью или кислотой приводит к образованию солевой формы. Ионы С1 или ОН" обмениваются на анионы белка. В случае ионного обмена прочность связи белка с ионитом определяется величиной заряда белка. Для разделения кислых и нейтральных белков используют анионообменники, для разделения основных белков — катионообменники. Элюцию осуществляют 1) буферными растворами с изменяющимися значениями pH (возрастающими или убывающими) при этом белки разделяются в соответствии с их зарядами, т.е. отходят от заряженной группы ионита в Р1 2) буферным раствором того же значения pH, но содержащим катионы (анионы) с большим сродством к ионообменнику (вытеснение по величине заряда). [c.51]

Некоторые исследователи изучали действие нейраминидазы и других ферментов на активность внутреннего фактора, полученного из слизистой желудка человека. По-видимому, обработка препарата нейраминидазой приводит к потере активности последняя измерялась с помощью теста Шиллинга [134—136]. Однако, если активность препарата измерять с помощью других тестов, как, например, связыванием витамина В12, то обработанный нейраминидазой препарат, очевидно, не теряет активности. Файллард и Прибилла [136] установили, что обработка препарата трипсином вызывает значительное понижение активности только после предварительной обработки препарата внутреннего фактора нейраминидазой. Далее эти авторы нашли, что если отщепленную сиаловую кислоту заменить сильно кислым катионообменником, то биологическая активность препарата по тесту Шиллинга восстанавливается. Пепсин и кислая среда вызывают инактивацию препаратов внутреннего фактора. Однако обработка препарата папаином не вызывает потерю активности [135]. [c.251]

Еще одно не менее важное в отношении катионообменной хроматографии наблюдение касается влияния других заряженных полимеров, особенно нуклеиновых кислот, присутствующих в наносимом образце. Электростатическое притяжение между заряженными макромолекулами может быть достаточно сильным при низкой ионной силе, используемой в ионообменной хроматографии, и положительно заряженные белки будут взаимодействовать с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Образовавшийся комплекс несет меньший по величине суммарный положительный заряд или даже может быть заряжен отрицательно и потому не связывается с катионообменником. Простой способ, который можно применить, чтобы избежать этого нежелательного явления, заключается в обработке образца поликатионом (обычно протамином), избирательно осаждающим нуклеиновые кислоты при незначительных потерях белка. Протаминсульфат, используемый в концентрации 1 г на 20—-40 г белка, перед добавлением к образцу предварительно растворяют в воде и доводят pH до нейтрального значения, так как этот поликатион обладает сильными кислотными свойствами. Ионная сила не должна быть высокой (<0,1). Комплексы нуклеиновых кислот с протамином образуются также за счет электростатических взаимодействий, и при высокой концентрации соли распадаются. Если было добавлено достаточное количество протамина, образуется обильный кремово-белый осадок, который можно удалить центрифугированием при умеренной скорости. Во многих случаях делается заключение о том, что катионообменная хроматография непригодна для работы с данным ферментом, так как он не прилипает к катио-нообменннку, тогда как истинная причина неудачи кроется в присутствии нуклеиновых кислот. [c.133]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология