Протаминсульфат

Обработка протаминсульфатом. К отдиализованному раствору до-бавляют по каплям, при перемешивании, раствор протаминсульфата до прекращения образования осадка, после чего центрифугируют 10 мин при 40 000 и осадок отбрасывают. [c.252]

Протаминсульфат — 2%-ный раствор, доведенный трисом до pH 7,0. [c.265]

Хроматография на КМ-целлюлозе. К раствору белка добавляют раствор протаминсульфата (1 г/50 мл воды), доведенный трисом до pH 7,0. Полученный осадок удаляют центрифугированием. Затем к супернатанту добавляют 0,01 объема 1 М раствора триса и понижают pH до 6,0 с помощью 1 М какодиловой кислоты. Разводят рйствор до 800 мл добавлением 10 мМ триса, содержащего 1 мМ ЭДТА (pH 6,0, доведено какодиловой кислотой), и наносят его на колонку (4,5x30см) с КМ-целлюлозой, уравновешенную 10 мМ трисом, 1 мМ ЭДТА, доведенным до pH 6,0 какодиловой кислотой. После нанесения белка на колонку начинают элюцию линейным градиентом КС1. Для создания градиента используют два сосуда, один из которых содержит 1 л буфера, а другой — 1 л буфера, приготовленного на 0,2 М КС1. Скорость тока — 120 мл/ч. Фракции, содержащие более 300 единиц активности фермента в 1 мл, объединяют. [c.266]

Обработка протаминсульфатом. К тканевому экстракту медленно, при помешивании, добавляют протаминсульфат из расчета 1 г на 20 г белка (рассчитанную навеску протаминсульфата предварительно растворяют в минимальном объеме бидис тиллированной воды). Перемешивают в течение 10 мин, после чего центрифугируют 15 мин при 40 ООО д и осадок отбрасывают. [c.285]

На первой стадии разрушают биологический материал. Обычно начинают с разрезания и затем механического размельчения в гомогенизаторе. Для разрыва клеточных стенок используются различные методы обработка ультразвуком, встряхивание со стеклянными шариками, растирание замороженного материала в ступке, осмотический шок, осмотический лизис дистиллированной водой, обработка поверхностно-активными веществами илн воздействие протеазами. Нежелательные составные части клеток могут быть отделены центрифугированием, нуклеиновые кислоты отделяют осаждением протаминсульфатом, углеводы — электрофорезом, липиды — низкотемпературной экстракцией органическими растворителями. [c.346]

Низкомолекулярный белок протаминсульфат, выделенный из спермы некоторых рыб, обладает слабо выраженными анти-коагулянтными свойствами. Он хорошо переносится (т. е. не вызывает нежелательных побочных эффектов) и поэтому применяется в медицинской практике уже свыше 20 лет. [c.450]

Лиофилизованные клетки (4 г) суспендируют в 80 мл 0,05 М буферного раствора малеата калия (pH 7,0), в который предварительно добавляют 2-меркаптоэтанол с таким расчетом, чтобы концентрация его составляла 0,1 моль/л. Смесь инкубируют 30 мин при 37 °С и 10 мин центрифугируют при 144 000 . К супернатанту (75 мл) добавляют 20 мл раствора протаминсульфата (10 мг/мл, нейтрализован раствором аммиака) и оставляют на 5 мин при 20 °С, после чего центрифугируют при 30 000 ц. Супернатант (95 мл) охлаждают до 2°С, прибавляют 27 г сульфата аммония и 0,1 мл меркаптоэтанола и, приливая 15 н. раствор гидроокиси аммония, доводят pH смеси до 6,35. После 5-минутной выдержки смесь центрифугируют 5 мин при 30 000 g и повышают pH супернатанта до 6,90, добавляя 15 н. раствор гидроокиси аммония, выдерживают еще 15 мин при 55°С (постоянное перемешцвание), охлаждают до 20°С и повторяют центрифугирование (30 000 g, 5 мин). К супернатанту (95 мл) прибавляют 0,1 мл 0,1 М раствора хлористого магния и 6 г сульфата аммония, доводят pH до 7,0, прибавляя 15 н. раствор гидроокиси аммония, и выдерживают 75 мин при 2°С. Осадок отделяют и очищают переосаждением. С этой целью его растворяют в 20,0 мл 0,05 М малеатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,1 моль/л меркаптоэтанола. К полученному раствору добавляют 5,9 г сульфата аммония и нейтрализуют, как описано выше, до pH 7,0. Смесь выдерживают 2 ч при 1 °С, выпавшие кристаллы отделяют центрифугированием и переосаждают, как описано выше. При этом кристаллы растворяют в 10—20 мл буфера с таким расчетом, чтобы концентрация белка в растворе составляла около 2 мг/мл. Добавляют сульфат аммония (305 мг/мл), суспензию нейтрализуют, после чего выдерживают 1 ч при 0°С, кристаллы отделяют и суспендируют при 4°С в буферном растворе, в который предварительно добавлен сульфат аммония (305 мг/мл). Активность фермента можно определить по приведенной ниже методике. За единицу активности принимают количество фермента, необходимое для того, чтобы в условиях анализа в течение 10 мин оптическая плотность раствора при 350 нм изменилась на 1,0. [c.82]

Было показано, что коацерватные капли способны концентрировать ферменты, избирательно поглощая их из окружающей водной среды [51]. В типичном эксперименте коацерваты готовили из гуммиарабика и протаминсульфата в растворе, содержащем лизат бактерий в фосфатном буфере. В этом лизате каталазная ак-ТТ.ЕКССТЬ была очень высокой. В систему добавляли перекись воде рсда, и активность фермента определяли титрованием перманганатом калия. Фермент можно инактивировать добавлением раз-ьеденной серной кислоты. Были приготовлены соответствующие снеси коацерватов, содержащие аюивный и неактивный фермент, t. каждом случае коацерваты отделяли центрифугирование. и вновь смешивали с равновесной средой. Данные этого эксперимента суммированы в табл. 29. Результаты свидетельствуют о том. [c.289]

В момент заражения монослой должен быть еще не плотным. Для некоторых рабдовирусов иногда трудно обеспечить строгую синхронизацию, необходимую для прохождения одного цикла размножения, даже при очень высокой множественности инфекции. Тем не менее инфицирование клеток большим количеством вируса для того, чтобы заразить каждую клетку, позволяет приблизиться к таким условиям. Действительно, если все клетки заражены, то, естественно, может пройти только один цикл репродукции вируса. Однако существует и верхний предел множественности инфекции. При очень высокой множественности может наблюдаться аномальная картина размножения вируса, обусловленная накоплением дефектных интерферирующих частиц (см. разд. 3.1.1) и реадсорбцией вирионов потомства на клеточном дебрисе. По-видимому, лучше всего в первом опыте использовать множественность инфекции 10 БОЕ/кл, а затем в случае необходимости увеличивать или уменьшать ее в 10 раз. Можно добавить к вирусу или культуральной среде некоторые полиионы для стимуляции связывания вируса с клетками и повышения инфекционности [13]. Такое стимулирующее воздействие оказывают диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)-декстран и протаминсульфат в концентрациях 50 и 100 мкг/мл соответственно, если их добавляют к клеткам до внесения вируса (за 4 ч или менее). После внесения вируса полиионы не оказывают стимулирующего действия. Важно отметить, что некоторые полиионы хотя и способствуют адсорб- [c.114]

ОЧИСТКА КОММЕРЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТАМИНСУЛЬФАТА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, КИСЛЫХ И основных БЕЛКОВ [c.236]

Рис. 25. Гельфильтрация препаратов протаминсульфата через сефадекс G-26.

Несмотря на наличие одного пика на элюционной кривой гари фракционировании на сефадексе G-25 протаминсульфата фирмы Weddel pharma euti al , степень осаждения нуклеиновых кислот и кислых белков у неочищенного препарата была в IV2—2 раза ниже, чем у этого же препарата после гельфильтрации. [c.239]

Протаминсульфат, очищенный гельфильтрацией, значительно лучше осаждал нуклеиновые кислоты и белки, чем протаминсульфат, очищенный хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе по ранее описанному методу (Phillips, West, 1964). [c.239]

Надосадочная фракция содержит основные белки, не осаждающиеся при дальнейшем добавлении протаминсульфата (фракция ОБ). [c.239]

Рис, 26. Титрование грубого бесклеточного препарата Azotoba ter vinelandii протаминсульфатом (ПС)-/ — поглощение при 260 нм, 2 поглощение при 280 нм, J — активность нитро-геназы, определенная по выделению На при давлении, равном 0,05 мм рт, ст., по методу В. А. Ивлева и др. 1971), [c.240]

Следует учитывать, что образование нерастворимых комплексов протаминсульфата с нуклеиновыми кислотами и кислыми белками обусловлено образованием свя- зи между фосфатными группами нуклеиновых кислот й карбоксильными группами белков с аминогруппой аргинина протаминсульфата. Эта связь имеет ионную природу, поэтому при повышении ионной силы раствора степень образования ионных связей между ЫНа-гр>тпами аргинина и фосфатными и карбоксильными группами резио снижается. При высоких концентрациях (МН4)2804 (выше 0,5 М) образование нерастворимого комплекса кислых белков с протамином может вообще не наблюдаться, даже при добавлении больших избытков протамина. [c.241]

В сердце голубя также был обнаружен фактор, способный активировать НАД-киназу. В качестве источника активатора использовали надосадочную 5<идкость, остающуюся после осаждения комплекса НАД-киназы с протаминсульфатом на одной из стадий очистки. Супернатант прогревали в течение 10 мин на пилящей водяной бане, отделяли коагулировавшие белки н фракцию, содержавшую активатор, получали путем высаливания сульфатом аммония до 60%-ного насыщения с последующим диализом. Как следует из данных табл. 2, эта термостабильная белковая фракция активирует НАД-киназу из сердца голубя в 1,3— 2,0 раза в зависимости от добавленного количества. По-видимому, как и в случае фермента из печени, эффект активатора на НАД-киназу из сердца голубя специфичен, так как добавление БСА в том же количестве не оказывало никакого влияния на активность фермента. [c.151]

Еще одно не менее важное в отношении катионообменной хроматографии наблюдение касается влияния других заряженных полимеров, особенно нуклеиновых кислот, присутствующих в наносимом образце. Электростатическое притяжение между заряженными макромолекулами может быть достаточно сильным при низкой ионной силе, используемой в ионообменной хроматографии, и положительно заряженные белки будут взаимодействовать с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Образовавшийся комплекс несет меньший по величине суммарный положительный заряд или даже может быть заряжен отрицательно и потому не связывается с катионообменником. Простой способ, который можно применить, чтобы избежать этого нежелательного явления, заключается в обработке образца поликатионом (обычно протамином), избирательно осаждающим нуклеиновые кислоты при незначительных потерях белка. Протаминсульфат, используемый в концентрации 1 г на 20—-40 г белка, перед добавлением к образцу предварительно растворяют в воде и доводят pH до нейтрального значения, так как этот поликатион обладает сильными кислотными свойствами. Ионная сила не должна быть высокой (<0,1). Комплексы нуклеиновых кислот с протамином образуются также за счет электростатических взаимодействий, и при высокой концентрации соли распадаются. Если было добавлено достаточное количество протамина, образуется обильный кремово-белый осадок, который можно удалить центрифугированием при умеренной скорости. Во многих случаях делается заключение о том, что катионообменная хроматография непригодна для работы с данным ферментом, так как он не прилипает к катио-нообменннку, тогда как истинная причина неудачи кроется в присутствии нуклеиновых кислот. [c.133]

Первая стадия очистки экстрактов, полученных из микроорганизмов и других быстрорастущих клеток, содержащих большие количества нуклеиновых кислот, состоит обычно в осаждении последних протаминсульфатом (см. разд. 2.3). Полученный осадок, как правило, содержит мало других белков, кроме [c.187]

Образование комплексов При обработке вируссодержащей суснензии протаминсульфатом образуются комплексы с частицами размером более 50 ммк, которые выпадают в осадок. Частицы менее 50 ммк остаются в надосадочной жидкости. При этом инфекционпость вируса не снижается, а образованный комплекс легко диссоциируется в 1 М Na l. [c.49]

Обработка протаминсульфатом — простая, эффективна и <(мягкаяпроцедура концентрирования и частично очистки вирусов. Ее обычно используют только в качеств предварительного этапа. [c.50]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология