Плазмиды челночные

Главным условием автономной репликации является наличие в составе плазмиды участков ri, т.е. области начала репликации. Эти участки резко отличаются у прокариот и эукариот. Поэтому челночный вектор должен содержать два таких участка. [c.304]

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами. Вместо онкогенов в вектор можно встраивать стандартными методами по сайтам рестрикции последовательности клонируемой ДНК [193, 194]. В таких челночных векторных плазмидах сайты рестрикции, по которым производят клонирование, расположены в искусственной Т-области, фланкированной вышеупомянутыми повторами. В качестве селектируемых маркеров в этих плазмидах используют расположенные в Т-области гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые позволяют отбирать трансформированные клетки растений. После введения клонируемой последовательности рекомбинантным вектором трансформируют клетки агробактерий и с их помощью при участии vzr-генов осуществляют перенос всей генно-инженерной конструкции в клетки растений. Гены вирулентности могут находиться как в составе самого вектора, так и в ira/15-положении на плазмиде-помощнике. Для получения генетически модифицированных растений суспензию агробактерий можно инкубировать с протопластами, интактными клетками, тканями, листьями или даже целыми растениями. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов. [c.140]

БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ (ЧЕЛНОЧНЫЕ) ВЕКТОРНЫЕ ПЛАЗМИДЫ [c.229]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих обычно применяют для синтеза гетерологичных белков, использующихся в научных или медицинских целях. Они представляют собой челночные векторы с сайтами инициации репликации вируса животных и Е. со//-плазмиды. Регуляторные элементы транскрипции обычно происходят из генома вируса животных или из геномов млекопитающих. Для отбора трансфицированных клеток используют доминантные селективные маркерные гены. Некоторые системы отбора основаны на введении в среду возрастающего количества цитотоксичного соединения и позволяют получать клетки, содержащие большое число копий вектора, что увеличивает выход чужеродного белка. [c.155]

Большинство плазмидных векторов с широким кругом хозяев реплицируются только в грамотрицательных микроорганизмах, поэтому необходимо создать векторы, специально предназначенные для экспрессии в oryneba terium и Breviba terium spp. Это могли бы быть челночные векторы Е. соИ- oryneba terium. Та их часть, которая происходит из плазмид Е. соН, может со- [c.255]

Нередко возникает задача ввести ген в клетки эукариот, например в дрожжевые клетки, в которых могут нарабатываться белки, прошедшие после их образования необходимые стадии модификации, несвойственные прокариотическим клеткам. Для этой цели используют специальные, так называемые челночные, векторы, которые могут автономтю размножаться как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, например в Е.соН и дрожжах. В эукариотические клетки плазмиды вводят на заключительных стадиях, поскапьку многие предварительные этапы клонирования существенно проще проводить в кле гках прокариот. [c.304]

В качестве иллюстраций векторных систем приводим рис 68а, на котором изображены плазмиды ol El, pBR322, вирус SV40 и челночный вектор [c.197]

Из-за размера и сложности Ti-плазмиды для получения полноценного трансформирующего вектора требуется провести ряд генно-инженерных манипуляций. С генами, предназначенными для переноса в растительные клетки, сначала манипулируют in vitro и в зависимости от того, становятся ли они частью коннтегративной или бинарной векторной системы, их включают в состав либо простой челночной плазмиды (коинтегративная система), либо более сложной плазмиды с широким кругом хозяев (бинарная система). Плазмиду затем вводят в Е. соИ [c.195]

В целях обеспечения возможности конструирования рекДНК в клетках Е. oh плазмидные векторы для работы с животными клетками делают челночными. Отметим, что в области 2067—2533 п.н. плазмиды pBR322 есть ядовитая последовательность, препятствующая репликации челночных векторов в животных клетках. Она отсутствует в ряде ее производных, в частности, в плазмиде рАТ153 (см. рис. 7.3), которые и следует применять для соответствующих конструкций. [c.406]

Репликатор вируса Эпштейна—Барр (EBV). Этот герпесви-рус инфицирует только В-лимфоциты приматов, не вызывая их лизиса. Некоторые из этих клеток приобретают способность к неограниченному делению, превращаясь в лимфобласты, в ядре которых вирусная кольцевая ДНК (172 т.п.н.) реплицируется и п эддерживается в виде мультикопийной плазмиды. На основе репликатора EBV создан ряд челночных плазмидных векторов. [c.409]

Челночная структура гибридных плазмид позволила провести спасение гомологичных трансгенов, с последующим рестрикционным анализом их структуры (рис. 87). Этот анализ показал, что молекулярный вес плазмид и их структура остались без изменений в случае с вектором р(27-8). Плазмиды с противоположной ориентацией вставки - р(27-8)+ были подвержены однотипным структурным перестройкам. Действительно, из электрофореграммы видно, что во всех вариантах спасенных трансгенов, имеющих данную ориентацию экзогенной ДНК, появлялся дополнительный низкомолекулярный фрагмент (0,5 т. п. н.). Наличие однотипной перестройки структуры вносимой ДНК, так же как и в случае вышеприведенных наблюдений за судьбой дериватов рг8а в трансгенных мышах, свидетельствует о направленном характере перестройки конструкции р(27-8)+ (рис. 87) (Легчилина и др. 2001). [c.234]

Наиболее эффективно экспрессия клонированных генов интерферона происходит в дрожжевых клетках. Интерфероновые гены клонировали в челночных бактериально-дрожжевых векторах, в которых они находятся под контролем дрожжевого промотора al DI. Дрожжевые клетки, трансформированные этой плазмидой, синтезируют до 10 молекул биологически активного интерферона на 1 клетку [98]. Недавно несколько генов а-ИФН и ген Y-ИФН были включены в плазмиды под контроль промотора 3-фосфоглицераткиназы, в результате чего были получены биологически активные интерфероны без сигнальной последовательности с выходом примерно 25 млн. ед. на 1 л [53]. [c.45]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология