Пульс-электрофорез

Недавно была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорез в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять очень большие, можно сказать громадные молекулы ДНК. Обычный гель-электрофорез не позволяет разделить такие молекулы ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентироваться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они будут отставать. На гелях после пульс-электрофореза целые хромосомы бактерий или дрожжей выявляются в виде отдельных полос (рис. 4-64, В), и поэтому можно легко определить хромосомные перестройки. Более того, используя гибридизацию молекул клонированной ДНК данного геля для поиска комплементарных последовательностей в геле, удалось картировать множество генов у дрожжей (см. разд. 4.6.8). [c.233]

ПУЛЬС-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ И МЕТОДЫ РАБОТЫ С БОЛЬШИМИ МОЛЕКУЛАМИ ДНК [c.58]

Рис. 2. Конфигурация электродов, позволяющая получить в геле типичное двойное однородное электрическое поле при пульс-электрофорезе.

Таблица 9. Стандартные условия пульс-электрофореза 1%-ная агароза, 12°С, модифицированный ТВЕ, конфигурация электродов, представленная на рис. 2,

Таблица 10. Ошибки при проведении пульс-электрофореза и возможные причины их возникновения

Частичное расщепление рестриктазой МЬо( в агарозе Отбор молекул нужного разме МЕ при помощи пульс-электрофореза [c.100]

ДНК, подвергаемая частичному гидролизу, должна быть достаточно высокомолекулярной (>1000 т.п.н.). Методика приготовления образцов ДНК та же, что и для пульс-электрофореза [10, 11], с той лишь разницей, что количество ДНК рассчитывается для препаративных целей. [c.101]

Обработанные рестриктазой препаративные блоки поместите в гель и, используя соответствующие маркеры, проведите пульс-электрофорез с интервалами между импульсами, позволяющими хорошо отделить фрагменты нужной величины. [c.103]

Шварц и Кантор (S hwartz, antor) разработали метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле (пульс-электрофорез), используемый для разделения очень больших молекул ДПК [c.218]

Метод пульс-электрофореза (ПЭФ) fl] дает возможность разделять ДНК индивидуальных хромосом дрол<жей и простейших [2, 3]. Размеры этих молекул варьируют от 0,2 до Юх Х10 нуклеотидных пар. В настоящее время создана технология выделения и обработки ДНК таких больших размеров как для эукариот, так и для прокариот [4—7]. Таким образом, теперь существует возможность изучать целые хромосомы (практически из любых организмов), последовательности ДНК которых насчитывают несколько миллионов оснований. Получены физические карты больших районов некоторых хромосом млекопитающих [8] и целой хромосомы Esheri hia oli [9]. Цель этой главы — рассказать читателям о биохимических методах, используемых при выделении больших молекул ДНК, и методах ПЭФ, применяемых для их анализа. Пульс-электрофорезу посвящено значительное количество обзоров [10, И, 12]. [c.58]

С тех пор как метод пульс-электрофореза был впервые описан [1], появилось большое количество сообщений о его вариантах. Разделение ДНК во всех этих случаях основывалось на одном и том же принципе. Молекулы ДНК подвергали внешнему воздействию, заставляющему их изменять направление движения. Быстрота, с которой молекулы делают это, зависит от их молекулярной массы, тогда как собственно электрофоретиче- [c.71]

В этом разделе помещены фотографии неудачных гелей после пульс-электрофореза, которые обычно не публикуют. Они приведены здесь в качестве примеров некоторых ошибок и проблем, с которыми могут столкнуться экспериментаторы. В большинстве гелей крайние дорожки содержат хромосомную ДНК 5. се-геугзгае, а соседние внутренние дорожки —конкатемеры ДНК фага в качестве стандарта размеров. Внутренние Дорожки содержат бактериальную ДНК или ДНК млекопитающих после [c.81]

На противоположном конце спектра работают методы генетики соматических клеток, гибридизация in situ, анализ генетического сцепления их разрешающая способность ограничена 1000—5000 т. п. и. И наконец, середине щкалы соответствуют три метода, позволяющие использовать данные картирования для поиска специфических молекулярных нарушений. Это пульс-электрофорез [6—И], прыжки по хромосоме [3—5] и клонирование в клетках дрожжей [12]. [c.97]

Из некоторых источников ДНК постоянно выделяется с небольшим количеством низкомолекулярных примесей размером 50—100 т. п. н., видимо из мертвых клеток. Наиболее характерно это для лимфобластов. Такие деградировавшие молекулы ДНК могут сильно искажать результаты прыжков по хромосоме , поэтому необходимо удалить их из агарозных блоков перед обработкой рестриктазами. Для этого блоки (как маленькие, так и большие) помещают в лунки ОРАОЕ-геля и проводят пульс-электрофорез в течение 2—3 ч с интервалами между импульсами 20 с. Молекулы ДНК размером менее 100 т. п.н. выходят из блоков в гель, а высокомолекулярная ДНК остается практически без изменения. Блоки затем можно изъять из геля, получив, таким образом, высококачественный материал для дальнейшего исследования. [c.102]

Поскольку для окончательной специфической библиотеки требуется меньше клонов, чем для стандартной, нет необходимости иметь изначально большие количества ДНК. Мы убеди-лиёь на практике, что для обработки рестриктазами нужно иметь около 10 мкг ДНК, а в итоге (для лигирования и упаковки) достаточно лишь 1 мкг из этогО кйличества. Первую обработку рестриктазами проводите с большим избытком фермента (10—20 ед./мкг), чтобы в библиотеке были представлены сайты, как правило не расщепляемые при работе с обычными концентрациями фермента. Следует обязательно про верить результаты расщепления, проведя пульс-электрофорез [c.114]

Проверьте эффективность Л оЛ-библиотеки. Это несколько проще, так как у значимых клонов обе половинки, составляющие прыжок, должны происходить из одного и того же Notl-фрагмента. Целесообразно идентифицировать 5—10 клонов, содержащих вставки уникальных последовательностей, а затем проверить обе половинки каждого клона- прыжка путем блот-гибридизации с ДНК, фракционированной пульс-электрофорезом. Это даст представление о варьировании размеров прыжков, представленных в библиотеке, а также о доле значимых прыжков. [c.116]

I I Частичное расщепление Mbol Фракционирование пульс-электрофорезом [c.120]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология