Бромистый этидий, применение

Выявление нуклеиновых кислот с помощью флуориметрии. В отличие от одноцепочечных двухцепочечные молекулы ДНК и РНК взаимодействуют с бромистым этидием [758]. Образующийся комплекс возбуждается под действием света с длиной волны 360 н.ч и излучает при этом свет с максимумом интенсивности при 580 нм [661]. Чувствительность определения составляет 50 нг для ДНК и 100 нг для РНК. Применение специфических нуклеаз позволяет различать ДНК и РНК. Бромистый этидий добавляют [645] к пробам до электрофореза в таком количестве, чтобы отношение бромистый этидий/фосфор ДНК составляло примерно 0,1. При этой концентрации он практически не влияет на подвижность нуклеиновых кислот. По окончании разделения гели можно сфотографировать, использовав подходящий источник света и оранжевый светофильтр 1176]. [c.184]

Высокомолекулярный шмир на фоне дискретных продуктов ПЦР или при полном их отсутствии. Шмир очень часто возникает при использовании плохо очищенных матриц. При появлении шмира светится вся дорожка в агарозном геле после проведения электрофореза и окрашивания его бромистым этидием. В этом случае имеют место множественные неспецифические инициации синтеза ДНК из-за присутствия в реакционной смеси низкомолекулярных затравок в виде неспецифических фрагментов ДНК или РНК, а также повторяющихся последовательностей в матрице, которые залипают друг на друга. Денатурированные белки, неспецифически удерживая концы фрагментов ДНК вблизи матрицы, могут создавать места множественной инициации синтеза ДНК и т.п. Имеются, по крайней мере, две возможности преодоления такого эффекта дополнительная очистка матрицы, например, с помощью фенольной депротеинизации или с использованием ионообменной смолы СЬе1ех-100 [270], а также, если по каким-то причинам хорошо очищенные матрицы недоступны, применение модифицированных ДНК-полимераз в ПЦР с горячим стартом (см. ниже). [c.206]

Таким образом, амплификация последовательностей ДНК in vitro находит широкое применение как в экспериментах по клонированию в составе молекулярных векторов, так и для прямого анализа вариантных состояний генов. Особое значение рассмотренный методический подход имеет при разработке простых тест-систем для выявления в организме нуклеиновых кислот инфекционных агентов. В настоящее время такие анализы стали рутинными. Многочисленные фирмы производят тест-системы для идентификации методом ПЦР (или ОТ-ПЦР) практически всех известных микроорганизмов, вызывающих заболевания человека и животных. В частности, этот подход используют для ранней диагностики наличия в организме вируса имм шодефицита человека (HIV), что не удается осуществить другими методами. При этом не требуется работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения фрагментов ДНК и окраски их бромистым этидием. [c.54]

В первых экспериментах такого гидролиза добивались с помощью импульсной обработки определенной рестриктазой молекул ДНК в присутствии бромистого этидия, который из-за ин-теркаляции между цепями ДНК затрудняет расщепление ферментом обеих цепей. Однако такой способ введения ника существенно ограничивает применение этих методов направленного мутагенеза, так как локализация разрыва строго зависит от используемой рестриктазы. Данное затруднение преодолели Д. Шортл с соавторами (1980 г.), которым удалось вводить ник в любой участок кольцевой молекулы ДНК (рис. 6.9). К суперскрученной кольцевой ДНК добавляется одноцепочечный сегмент ДНК, гомологичный последовательности, по которой необходимо ввести ник. Затем к этой смеси добавляют [c.178]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология