Амплификация репликация последовательностей

Во всех известных на сегодняшний день случаях не только геномные копии, но и кДНК любого из этих генов в составе экспрессирующего вектора способны к амплификации в трансфицированных культивируемых клетках (см., например, [6—9,11,12]). Следовательно, вряд ли существует некая специфическая последовательность ДНК, ответственная за амплификацию. И хотя механизм этого явления изучен недостаточно полно, можно все-таки предположить, что в ходе селекции происходит лишь фиксирование определенных случайных событий амплификации, возникающих независимо с определенной частотой во всех пролиферирующих клеточных популяциях. Одна из гипотез связывает эти события с ошибками репликации ДНК [2]. С этой гипотезой согласуется наблюдение о том, что амплифицирующиеся участки хромосомной ДНК во всех случаях значительно превышают по размеру собственно кодирующую последовательность фермента (часто амплифицируются фрагменты длиной более 1000 т. п.н.). Точно так же при селекции на амплификацию клонированных генов увеличивается число копий и других последовательностей вектора — они тоже вовлекаются в амплификацию. [c.240]

Примечание. QPR-QP-репликация, L R - лигазная цепная реакция, 3SR-изотермическая самоподдерживающаяся репликация последовательностей, SDA -амплификация с замещением цепи ДНК [c.249]

Современное руководство по биотехнологии, написанное авторитетными канадскими учеными. В книге подробно изложены основы генной инженерии механизмы репликации, транскрипции и трансляции методы клонирования, амплификации и секвенирования ДНК конструирование рекомбинантных ДНК введение последовательностей-мишеней в геном микроорганизмов, растений и животных, а также практическое применение генной инженерии для получения лекарственных веществ, вакцин, факторов роста, инсектицидов и т.д. Большое внимание уделено генной терапии и связанным с ней морально-этическим проблемам, патентованию биотехнологических продуктов и способов их получения. [c.4]

Использование Qp-репликазы для амплификации нуклеотидных последовательностей. Этот способ амплификации осуществляется на уровне РНК с использованием РНК-репликазы, которая обычно участвует в репликации геномной РНК колифага Q(3 329]. Соответствующие РНК-матрицы могут быть получены субклонированием требуемых последовательностей в виде фрагментов ДНК, внедренных в последовательности Qp-ДНК под контроль промотора Т7-РНК-полимеразы в подходящем векторе. С помощью Т7-РНК-полимеразы на ДНК-матрице такого плазмидного вектора можно получать копии РНК, которые будут служить матрицами при синтезе РНК Qp-репликазой in vitro. При более общем подходе к реализации этих идей получают два РНК-зонда, которые гибридизуются с соседними последовательностями анализируемой РНК таким образом, что между ними остается одноцепочечный разрыв, который может быть ликвидирован с помощью Т4-ДНК-лигазы. Оба зонда по отдельности не могут реплицироваться Qp-репликазой, однако, после ковалентного соединения в составе объединенной молекулы становятся для нее хорошей матрицей (рис. 30). [c.248]

ВЫБОРОЧНАЯ РЕПЛИКАЦИЯ saltatory repli ation). Побочная амплификация, приводящая к появлению большого количества копий какой-либо последовательности. [c.520]

Использование с этой целью векторов ВРУ-типа удобно в том отношении, что довольно быстро устанавливается множество копий вируса (до нескольких сотен на клетку). Этим объясняется успешное применение вектора на основе ВРУ для высокоэффективной экспрессии многих белков [1]. Недостатки вирусных векторов связаны с ограниченным набором клеточных линий, в которых возможна репликация вектора, а уровень экспрессии и поддержание эписомного состояния конструкции в целом зависят кроме всего прочего и от конкретных последовательностей ДНК, клонированных в векторе. Альтернативный способ увеличения числа копий, описанный в данной главе, предусматривает селекцию клеток на амплификацию последовательностей вектора после его интеграции в ДНК клетки-хозяина такой подход не имеет принципиальных ограничений на использование того или иного типа клеток. При этом подходе можно выбрать клетки с любыми нужными свойствами, например способностью определенным образом модифицировать белковый продукт или узнавать конкретную регуляторную последовательность ДНК. [c.239]

Синтез РНК, осуществляемый рр-репликазой, характеризуется очень высокой эффективностью. В общем случае удается получать 107-108 копий исходной последовательности. При этом репликация может начинаться с одной молекулы. Однако реализация этого метода сталкивается с рядом технических трудностей. В частности, сама р(3-репликаза является сложноустроенным четырехсубъединичным ферментом и не всегда доступна. Кроме того, имеется целый ряд ограничений, накладываемых на последовательности анализируемой РНК, что вызвано соблюдением структурных особенностей молекул, распознаваемых репликазой. Все это ограничивает широкое распространение системы в анализе ДНК. Тем не менее, этот подход в будущем может оказаться весьма полезным в тех случаях, где требуется очень высокий уровень амплификации последовательностей при постоянной температуре, а в настоящее время он успешно используется для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека. [c.249]

Реитерация последовательностей может происходить в результате общей рекомбинации между неаллельными i омологичными участками ДНК (разд. 2.4). Последовательные раунды такого неравного кроссинговера могут приводить к удлинению или укорочению длинных тандемных повторов. Вначале амплификация может захватывать довольно короткие гомологичные участки (рис. 9.31)-такие, как нонануклеотиды, встречающиеся с большой частотой в сателлитной ДНК мыши. Известная пластичность тандемных повторов в значительной степени обусловливается неравной гомологичной рекомбинацией, хотя нельзя исключить и такие механизмы, как генная конверсия или проскальзывание ДНК во время репликации. [c.195]

B. Чтобы стимулировать избыточную репликацию кластера генов, кодирующих белки хориона, контролирующий амплификацию элемент, размер которого составляет 510 нуклеотидов, должен находиться в точке начала репликации. Однако этот элемент не может представлять собой обычную точку начала репликации в нем должны также содержаться последовательности, которые на определенных стадиях развития фолликулярных клеток препятствуют блокаде повторной репликации. Поскольку механизм блокады неизвестен, трудно строить предположения о том, из-за чего он мог бы не сработать. Однако представляется вероятным, что белки фолликулярных клеток, специфичные для определенных стадий развития, связываются с точкой начала репликации или вблизи нее, в результате чего этот сайт сохраняет свою активность. Может также оказаться, что сама по себе эта точка начала репликации нечувствительна к блокаде повторной репликации, но активна лишь в фолликулярных клетках, находящихся на определенной стадии развития (подобно встроенной в хромосому точке начала репликации 8У40, которая молчит в отсутствие Т-антигена см. задачу 9-20). С другой стороны, эта точка начала репликации может быть активна во всех тканях, но становиться нечувствительной к блокаде повторной репликации, взаимодействуя со специфическим белком, присутствующим в фолликулярных клетках. [c.397]

Множественные копии амплифицированной последовательности локализованы в одной или реже в нескольких хромосомах. Амплифицированная область хромосомы может содержать до нескольких сотен последовательностей изучаемого гена. При этом наряду с прямыми повторами могут быть и инвертированные, а также иногда наблюдаются перестройки в амплифици-руемых последовательностях. Эффективность амплификации интегрированного в геном клетки гена и стабильность хромосом, содержащих амплифицированный ген, существенно зависят от места интеграции трансформирующего гена (эффект положения гена). Обнаружено, что в амплифицируемом сегменте ДНК находится участок инициации репликации (ori) хромосомной ДНК. Это позволяет из ДНК линий клеток с высокой степенью амплификации изучаемого сегмента достаточно просто выделять рестрикционный фрагмент, содержащий данный хромосомный ori, и клонировать его. [c.344]

В 1988 г. О. Хирен с соавторами предложили другую модель амплификации сегмента ДНК без выщепления его из состава хромосомы (рис. 13.8). Важное значение для этой модели имеют палиндромные последовательности, которые обусловливают поворот полимеразного комплекса, в результате чего образуются две вилки репликации, движущиеся друг за другом. [c.346]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология