ДСН-электрофорез гибридных белков

Проанализируйте фракции, собранные при гель-фильтрации методом ДСН-электрофореза в ПААГ [ 7] и отберите фракции, содержащие гибридный белок (примерно 160 мг). [c.111]

При электрофорезе частично очищенных и обогащенных белковых экстрактов можно выделить интактный гибридный белок из расчета не менее 1 мг белка на одну пластину геля. [c.157]

Для выявления области геля, содержащей гибридный белок, после электрофореза вымочите гель в охлажденном 0,1 М КС1. Холодный раствор, содержащий ионы К+, преципитируют ДСН в дорожках геля, в результате чего появляются соответствующие фракционированным белкам белые полосы. Такую полосу, соответствующую гибридному белку, можно вырезать из геля острой бритвой. Это устраняет необходимость фиксации и окраски кумасси полосы геля с исследуемым белком или параллельных дорожек геля. [c.157]

Препаративный электрофорез в акриламидном геле может быть использован на любой стадии очистки гибридного белка для его выделения в качестве неповрежденного, но денатурированного иммуногена. ДСН-лизаты клеток, полученные, как описано выше в разд. 5.3.2, после осветления центрифугированием могут быть непосредственно нанесены на гель. Белок примерно из 15 мл клеток, лизированных в 1,25 мл буфера для нанесения, содержащего 1,5% ДСН, можно исследовать, используя одну пластину геля с площадью поперечного сечения 2,0 см . [c.155]

Из результатов ДСН-электрофореза в ПААГ можно видеть, что гибридные белки Gal.T.HA и Gal.VPl.HA, по-видимому, частично деградировали, в то время как гибридный белок Gal.T.HD, судя по всему, совершенно стабилен. При индукции ИПТГ в течение меньшего периода времени не наблюдалось изменений в степени деградированности Gal.T.HA. Из этого следует, что некоторые гибридные белки, кодируемые клонированными фрагментами и продуцируемые в бактериальной клет-ке-хозяине, непосредственно после синтеза подвергаются про-теолизу. [c.178]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология