Вестерн-блот-анализ

Таблица 5.2. Обнаружение антител к индивидуальным антигенам с помощью вестерн-блот-анализа

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. [c.57]

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

S.4.2.4. Определение специфичности антител методом вестерн-блот-анализа [c.168]

ДСН-электрофорез в ПААГ в присутствии и в отсутствие 2-меркаптоэтанола с последующим вестерн-блот-анализом и иммунологическим анализом. [c.121]

Таблица 6.8. Вестерн-блот-анализ [c.188]

Мы также приводим методику эффективной постановки вестерн-блот-анализа с использованием моноклональных антител (табл. 6.8). Исходя из нашего опыта, моноклональные антитела четко делятся на две группы антитела, работающие в таком анализе, и не работающие антитела. Работающие в блот-анали-зе антитела воспроизводимо эффективны, но никакими изменениями условий ренатурации белков нам ни разу не удалось сделать так, чтобы антитела, не работающие в блот-анализе, вдруг заработали. Интересно, что такие неработающие антитела оказываются достаточно эффективными при скрининге колоний (табл. 6.1), позволяя картировать их некоторые эпитопы. [c.197]

Анализ рекомбинантных продуктов включает такие методы, как гель-электрофорез с последующим окрашиванием кумасси, вестерн-блот-анализ, иммуноферментный анализ и другие широко используемые процедуры, не требующие каких-либо специальных модификаций для работы с дрожжами поэтому мы их здесь не описываем. [c.236]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Очень важно установить, имеются ли в сыворотке иммунизированной мыши антитела к белкам, кодируемым вставочными последовательностями. Для этого используют ряд подходов в зависимости от того, насколько легко получить полноразмерный нативный продукт ОРС. Если известно, что ОРС экспрессируется в культивируемых клетках определенной линии или что ее продукт в достаточном количестве присутствует в определенной ткани, тогда можно определить активность сыворотки в отношении данных клеток или тканей с помощью иммуноци-тохимических методов, иммунопреципитации или вестерн-блот-анализа. По нашим данным, при работе с ОРС млекопитаю- [c.182]

Первичный анализ экспрессируемых в дрожжевой системе чужеродных белков проводят с помощью электрофореза в геле. Если эффективность экспрессии белка достаточно высока, соответствующую полосу в геле можно визуализировать кумасси голубым или путем окрашивания серебром. При низком уровне экспрессии придется использовать вестерн-блот-анализ с антителами к данному белку. Далее необходимо провести биологический анализ для того, чтобы подтвердить наличие у экспрессируемого дрожжевой клеткой продукта ожидаемой биологической активности. Нередко белки, продуцируемые в цитоплазму, не обладают соответствующей активностью. Секреция экспрессируемого продукта в среду помогает преодолеть эти трудности. [c.236]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология