Стабильность гибридных молекул ДНК в клетках

Рис. 4.8. Встраивание чужеродной ДНК в плазмидный вектор. Плазмидную ДНК, обработанную рестриктазой и щелочной фосфатазой, смешивают с рестрицированной донорной ДНК, содержащей нужный ген, и добавляют ДНК-лигазу. Два из четырех одноцепочечных разрыва при этом устраняются, и конструкция оказывается стабильной благодаря образовавшимся фосфодиэфирным связям. После введения гибридной ДНК в клетку-хозяина происходит ее репликация и образуются новые кольцевые молекулы уже без разрывов.

СТАБИЛЬНОСТЬ ГИБРИДНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ [c.338]

Таким образом, при клонировании чужеродных фрагментов ДНК в составе внехромосом-ных векторов Е. соН нужно учитывать целый спектр параметров, влияющих на стабильность гибридных молекул в бактериальной клетке. Предпочтительно в качестве реципиентов гибридных ДНК использовать штаммы Е. oli, дефектные по системе общей рекомбинации и поддерживающие плазмиды в мономерной форме. При конструировании гибридных моле- [c.210]

Векторная молекула должна обеспечивать также стабильное наследование гибридных молекул. Для обеспечения интеграции чужеродной ДНК в векторной молекуле необходимо присутствие сайтов расщепления рестриктазами, которые должны локализоваться в области, не существенной для репликации векторной молекулы. Наконец, векторная молекула должна нести хотя бы один генетический маркер, позволяющий фенотипически определить ее присутствие в клетке-хозяине. Любая молекула ДНК, обладающая данными свойствами, может использоваться как вектор. [c.143]

При конструировании in vitro гибридных молекул ДНК и последующем введении их в клетки Е. oli возникают дополнительные проблемы как со стабильностью наследования этих молекул, так и с устойчивостью их структуры. В частности, встроенный в плазмиду сильный гетерологичный промотор может нарушить поддержание гибридных молекул ДНК в бактерии. Такой эффект обусловлен тем, что интенсивная транскрипция с клонированного промотора подавляет репликацию плазмиды и, следовательно, приводит к снижению ее копийности. Стабилизировать такие гибридные плазмиды удается, если встроить в них терминатор транскрипции в 3 -положении от сильного промотора. [c.207]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Время жизни молекулы белка обычно соответствует той функции которую он вьшолняет in vivo например, структурные бели относятся к долгоживущим, тогда как регуляторные белки-это как правило, короткоживущие молекулы. Время жизни бели в эукариотической клетке может сильно зависеть от его N-конце вой аминокислоты. В опытах, с помощью которых было показан влияние N-концевых аминокислот на стабильность белка, исполь зовали гибридный белок, состоявший из убикитина, ковалентш сшитого с р-галактозидазой. Исследователи, обнаружившие это явление, изучили разнообразные плазмиды, кодирующие различные варианты гибридного белка. Три такие плазмиды схемати чески представлены на рис. 8-1. Когда эти плазмиды вводили [c.102]

Ряд генов Е. соН, влияющих на стабильность поддержания плазмидных молекул, уже выявлен. Так, для репликации плазмид olEl-типа необходимы различные факторы клетки-хозяина, в частности ДНК-полимераза I и РНК-полимераза. Мутанты Е. соН, дефектные по ДНК-гиразе, эндонуклеазам I, III и V, характеризуются повышенной частотой утраты плазмид типа olEl. Тем не менее о взаимоотношениях плазмиды с клеткой-хозяином известно еще очень мало. Например, найдены штаммы Е. соЫ, обеспечивающие стабильное поддержание гибридных плазмид, однако генетическая основа этого явления пока не установлена. Дальнейшие исследования позволят более целенаправленно формировать генотип штамма- [c.207]

В целом современное понимание процессов проникновения экзогенных молекул ДНК в клетки животных и поддержания этих молекуп в гетерологичном окружении позволяет целенаправленно конструировать гибридные ДНК, вводить их в культивируемые клетки, отбирать сублинии, стабильно сохраняющие введенную генетическую информацию, и изучать экспрессию чужеродных генов. [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология