Индикаторные гены

Изучение регуляторных последовательностей с помощь индикаторных генов......... [c.4]

Использование AT в качестве индикаторного гена дли изуче ния контроля экспрессии генов в различных органах и при из менении условий среды.......... [c.4]

Индикаторные гены использовались во многих работах по изучению экспрессии генов растений, находящихся под контролем клонированных 5 -последовательностей или нуклеотидных последовательностей, кодирующих транзитный пептид (разд. 6.9). Такие химерные гены обладают рядом преимуществ продукты их трансляции часто можно использовать в [c.309]

Рис. 6.2. Слияние промоторных областей генов растений с индикаторными генами бактерий.

Свойства транзитных пептидов были изучены недавно путем их соединения (вместе с промоторными участками) с индикаторным геном npt-II) [49, 54]. Таким образом исследовали [c.342]

Л. Слияние геиов и индикаторные гены [c.363]

Благодаря использованию чувствительных индикаторных ферментов в значительной степени упрощается анализ генов, подвергшихся направленному мутагенезу, если они введены в какие-либо организмы при трансформации. Если использовать индикаторный ген, кодирующий фермент, который отсутствует в изучаемом организме, то чувствительность выявления химерного гена ограничена лишь свойствами индикаторного фермента и методами его определения. [c.363]

Изучение регуляторных последовательностей с помощью индикаторных генов..............308 [c.406]

Известно два основных нути желаемая структура может быть образована в один этап, нанример, в результате рекомбинации в пределах короткого района гомологии — при введении последовательностей, содержащихся в селекционной плазмиде, в специфический участок космидного клона (рис. 3.3). Примером может служить подстановка энхансерных или промоторных последовательностей в участок, предшествующий гену, введение селективных маркеров или индикаторных генов (устойчивости к неомицину, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, р-га-лактозидазы) под контроль промотора, который несет космида, или создание случайных составных сегментов, образованных гомологичными генами, принадлежащими космиде и плазмиде. При необходимости может быть использован перенос в клетки-хозяева, непермиссивные для репликации одного из этих компонентов, что позволяет элиминировать независимо реплицирующиеся плазмиды, возникающие в результате вторичных рекомбинационных событий. Сходным образом селекционные плазмиды с последовательностями, гомологичными космидному вектору, используют для введения специфических последовательностей (например, маркеров, селектируемых в эукариоти- [c.85]

Аналогично этому были разработаны векторы, содержащие беспромоторные индикаторные гены с множественным линкером в 5 -области для встраивания промоторных последовательностей в качестве примера можно привести вектор для тестирования промоторов pGA482, который был описан в 1986 г. [3]. [c.29]

Особый случай представляет использование генов- репорте-р0В5> — индикаторных генов. Их применяют при разработке си-, схем трансформации для транзиторной или кратковременной [ transient ) экспрессии, при предварительном анализе конструируемых векторов (гл. 3) и тестировании последовательностей ДНК, способных регулировать экспрессию генов в стабильно трансформированных тканях (гл. 6). [c.101]

Работа, проведенная Фроммом с соавторами [12], помогла определить условия, дающие максимальную экспрессию легко скринируемого продукта индикаторного гена (хлорамфениколацетилтрансферазы, AT) после электропорации протопластов векторной ДНК, несущей этот ген (анализ данного фермента описан в разд. 6.4.2). В этих экспериментах было показано, что эффективность электропорации, которая измеряется количеством ДНК, поглощенной протопластами, можно количественно связать с активностью AT. Поэтому оптимизация методики электропорации заключается в том, чтобы подвергать популяцию протопластов различным по напряжению, длительности и времени спада импульсам, а также использовать серии импульсов, а затем анализировать через соответствующее время активность AT. Результаты таких экспериментов менее прямые, чем кажется на первый взгляд, поскольку увеличение напряжения и длительности импульса приводит к пропорцио нальному увеличению гибели клеток. В результате величина ак тивности AT, выявленной в популяции протопластов, недо оценивает количество вектора, включенного каждой клеткой Поэтому эффективность электропорации зависит от того, изме ряют ли ее на всей исходной популяции или на тех клетках, которые остаются жизнеспособными после обработки. Фромм с соавторами [12] сообщил, что импульс длительностью 54 мс при 350 В обеспечивает максимальную активность AT и она достигает пика через 24—48 ч после электропорации. Однако [c.215]

Изучаемую промоторную последовательность можно соединить с индикаторным геном путем транскрипционного либо трансляционного слияния. Для того чтобы получить транскрипционное слияние, область промотора индикаторного гена вырезают как можно ближе к ATG (кодон инициации трансляции), и затем этот ген непосредственно соединяют с изучаемым промотором. Если блок ТАТА нового промотора оказывается на соответствующем расстоянии (30—40 п. н.) от сайта ATG, то образуется химерный транскрипт, способный к нормальной трансляции с образованием фермента дикого типа (рис. 6.2). Если же необходимо получить трансляционное слияние, то ATG промоторной последовательности вместе с несколькими кодонами гена, который он обычно регулирует, соединяют с индикаторным геном, у которого в этом случае отсутствует свой собственный кодон ATG. Последний подход связан с двумя основными трудностями. Во-первых, соединение генов должно быть осуществлено таким образом, чтобы в транскрипте не происходило сдвигов рамки считывания и не возникали стоп-кодоны трансляции, что может приводить к образованию бессмысленных полипептидов или коротких фрагментов белка соответственно. Во-вторых, хотя и возможно обеспечить слияние таким образом, чтобы следующий за ATG кодон представлял собой первый кодон индикаторного гена, это может потребовать значительных усилий. Таким образом, в большинстве случаев на iN-KOHue гена растения подбирается (или конструируется) подходящий рестриктный сайт, который обеспечивает трансляционное слияние без нарушения рамки считывания. В таком случае индикаторный ген должен функционировать более нли менее нормально, причем к N-концу кодируемого им белка добавляется несколько лишних аминокислот. Если таким образом использовать AT и NPT-II, то лишние аминокислоты (см. например, [46]) не оказывают существенного влияния на активность ферментов. [c.309]

Экспрессия генов контролируется на самых разнообразных уровнях, включая инициацию транскрипции или трансляции, процессинг, транспорт или распад мРНК либо белка. Экспрессия одного и того же гена может регулироваться на одном или нескольких уровнях, что затрудняет исследования определенного контролирующего элемента. Как же тогда изучать отдельные элементы механизма, под контролем которого находится ген Точное слияние исследуемых генов с индикаторными представляет собой изящный метод, позволяющий упростить эту задачу. Например, для определения роли транскрипционного контроля необходимо удалить большинство или все последовательности, кодирующие белок, включая специфические сигналы для пост-трансляционной модификации, и заместить их последовательностями хорошо изученного индикаторного гена. [c.363]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология