Хлорамфениколацетилтрансфераза

Работа, проведенная Фроммом с соавторами [12], помогла определить условия, дающие максимальную экспрессию легко скринируемого продукта индикаторного гена (хлорамфениколацетилтрансферазы, AT) после электропорации протопластов векторной ДНК, несущей этот ген (анализ данного фермента описан в разд. 6.4.2). В этих экспериментах было показано, что эффективность электропорации, которая измеряется количеством ДНК, поглощенной протопластами, можно количественно связать с активностью AT. Поэтому оптимизация методики электропорации заключается в том, чтобы подвергать популяцию протопластов различным по напряжению, длительности и времени спада импульсам, а также использовать серии импульсов, а затем анализировать через соответствующее время активность AT. Результаты таких экспериментов менее прямые, чем кажется на первый взгляд, поскольку увеличение напряжения и длительности импульса приводит к пропорцио нальному увеличению гибели клеток. В результате величина ак тивности AT, выявленной в популяции протопластов, недо оценивает количество вектора, включенного каждой клеткой Поэтому эффективность электропорации зависит от того, изме ряют ли ее на всей исходной популяции или на тех клетках, которые остаются жизнеспособными после обработки. Фромм с соавторами [12] сообщил, что импульс длительностью 54 мс при 350 В обеспечивает максимальную активность AT и она достигает пика через 24—48 ч после электропорации. Однако [c.215]

Рис. 6.8. Радиометрическое определение хлорамфениколацетилтрансферазы, А. Структура хлорамфеникола с указанием сайтов ацетилирования при участии AT.

Кроме вышеупомянутой -галактозидазы в качестве белков-репортеров в настоящее время интенсивно используются и другие природные или генетически модифицированные белки, включая хлорамфениколацетилтрансферазу, различные флуоресцирующие белки, например, люциферазу светлячков, обелин, экворин, а также зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его аналоги. Флуоресцирующие белки, т.е. белки, способные испускать свет в результате контакта с электромагнитным излучением, в последнее время получили очень широкое распространение. Поэтому некоторые их свойства и области их применения будут кратко рассмотрены ниже. [c.383]

Вы изучаете экспрессию генов, соединенных с регулируемым глюкокортикоидами сегментом вируса саркомы мышей Моло-ни. Вы создали набор молекул ДНК, содержащих вирусный сегмент в обеих ориентациях выше и ниже репортерцого гена (хлорамфениколацетилтрансферазы, AT). Затем вы провели трансфекцшо этими ДНК двух клеточных линий, происходящих из разных тканей, и измерили активность AT в присутствии и в отсутствие глюкокортикоида (дексаметазона). Изменение ориентации и местоположения вирусного сегмента относительно слабо влияло на экспрессию репортерного гена-результат, который следует ожидать, если вирусный сегмент содержит энхансер транскрипции. Результаты трансфекции одним лишь геном AT я геном AT, соединенным с вирусным сегментом в одной (фиксированной) ориентации, показаны на рис. 12-3. Вы озадачены результатами для клеточной линии 1 вирусный сегмент усиливает экспрессию AT в 20 раз в отсутствие дексаметазона [c.219]

Е. соИ с Тс на Тс ". Во многом аналогично сконструированы плазмиды Е. соИ, содержащие ген хлорамфениколацетилтрансферазы ( at), у которого делетирован промотор, но сохранена структурная часть. Эти плазмиды также обеспечивают возможность клонирования последовательностей ДНК, которые в клетках Е. соИ функционируют как промоторы. По степени устойчивости к антибиотику, детерминируемой гибридными промоторсодержащими плазмидами, можно осуществлять косвенную оценку эффективности функционирования отобранных промоторов. [c.97]

Примечание. Активность хлорамфениколацетилтрансферазы выражена в общепринятых единицах. [c.282]

Плазмида pSV2- ai, содержащая кодирующую последовательность бактериального гена хлорамфениколацетилтрансферазы, также позволяет отбирать клоны трансформантов разных культур клеток на среде с хлорамфениколом. [c.349]

Рис. 10-20. А, Конструирование ряда мутантов по регуляторной области путем олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. У каждого мутанта изменен блок из четырех нуклеотидных пар. Таким образом, для изучения 108 нуклеотидов в энхансере р-глобина необходимо получить 27 последовательных мутантов. Б. Встраивание мутантного энхансера Р-глобина в специальную тест-плазмиду. Олигонуклеотид и клонирующий сайт сшиваются ДНК-лигазой. Белок, образуемый рекомбинантным геном, представляет собой бактериальный фермент хлорамфениколацетилтрансферазу ( AT), активность которого леп о определить. В. Исследование мутантных эихаисеров по их воздействию на синтез РНК. Синтез РНК измеряется косвенным образом по количеству белка, образуемого рекомбинантным геном (т. е. по активности AT).

Смотреть страницы где упоминается термин Хлорамфениколацетилтрансфераза: [c.169] [c.193] [c.515] [c.173] [c.10] [c.10] [c.97] [c.199] [c.217] [c.308] [c.333] [c.333] [c.401] [c.113] [c.139] [c.212] [c.225] [c.230] [c.242] [c.245] [c.250] [c.258] [c.265] [c.300] [c.351] [c.365] [c.420] [c.422]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология