Пептиды лигирование

Как можно видеть из вышеизложенного, метод EPL обладает большими преимуществами перед подходами, основанными на использовании только химических методов синтеза полипептидов. При использовании лигирования синтезированных белков большая часть белковой молекулы может быть синтезирована рибосомами, и полученные фрагменты полипептидных цепей далее легко объединяются с пептидами, синтезированными хими- [c.316]

При другом общем подходе полусинтеза белков используют протеолитические ферменты для лигирования пептидов. В этом случае для обращения протеолитической реакции условия реакции изменяют таким образом, что аминолиз промежуточного пептидил-ферментного комплекса становится предпочтительнее его гидролитического расщепления. Необходимые условия создаются путем включения в реакционную смесь органических растворителей, таких как глицерин, диметилформамид или ацетонитрил. При наличии в реакционной смеси второго пептида в процессе аминолиза происходит его объединение с пептидом из комплекса посредством амидной связи [52,53]. Обратный протеолиз был успешно использован для лигирования пептидов с папа-ином, трипсином и субтилизином. С использованием такого рода [c.307]

Еще один подход, позволяющий осуществлять лигирование полностью незащищенных пептидов в водных растворах при нейтральных значениях pH, был разработан в лаборатории С. Кента в 1994 г. [57]. В этом случае на первом этапе проводят химиосе-лективную реакцию между пептидом, содержащим N-концевой [c.310]

Рис. 40. Освобождение целевого белка из рекомбинантного предшественника, содержащего интеин, и его спонтанное лигирование с другим пептидом по механизму EPL [45

Мутационная замена Asn Ala в С-концевой части интеина блокирует последнюю стадию сплайсинга рекомбинантного белка (см. рис. 39), при конструировании которого нуклеотидная последовательность целевого белка 1 была объединена в коммерческом экспрессирующем векторе в одной рамке считывания с последовательностями нуклеотидов мутантного интеина и хитин-связыва-ющего домена ( BD) бактериальной хитиназы. Последний в рекомбинантном белке выполняет роль лиганда, взаимодействующего с иммобилизованным рецептором (хитином), что необходимо для очистки белка с помощью аффинной хроматографии после связывания хроматографическим носителем целевой белок вырезается из полипептида с помощью добавленного тиола (R-HS) в реакции межмолекулярной трансэтерификации, и образовавшееся производное может быть далее лигировано с пептидом, содержащим остаток a- ys. Таким образом, процесс EPL объединяет в себе две стадии тиолиз с участием интеина и спонтанное химическое лигирование нативных белков [c.314]

Вследствие более значительного перекрывания полинуклеотидов, чем олигонуклеотидов, лигазные комплексы обладают большей стабильностью, что в ряде случаев позволяет получать целевые гены одностадийной ферментативной реакцией. Так, гены пептида III, активирующего рост соединительной ткани (85 АК), и уби-квитина (76 АК) были получены одностадийным лигированием 20 полинуклеотидов длиной от 28 до 32 нуклеотидных звеньев и 8 полинуклеотидов длиной от 50 до 64 нуклеотидных звеньев соответственно. В первом случае успех был обусловлен, кроме всего прочего, применением специальной программы Repeat для поиска непро-д тстивных комплексов. Путем вариации кодонов в последовательности гена пептида III было предотвращено образование неправильных комплексов, в которых возможно взаимодействие 8 и более пар оснований. [c.69]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология