Белковый блоттинг

Вестерн-блоттинг (Western blotting) Перенос белковых молекул, разделенных с помощью гель-электрофореза, на твердую подложку. [c.545]

Вестерн-блоттинг — это исключительно чувствительный аналитический метод. С его помощью в грубом белковом экстракте можно выявить до 50 нг антигена, а в более чистых препаратах и еще меньшие количества. Хотя здесь метод вестерн-блоттинга описан как альтернативный анализу in situ для выявления экспрессии NPT-II в трансформированных тканях (разд. 6.7.3), приведенные ниже методики можно оптимизировать для исследования многих других белков. Хорошим примером служит работа Джонниса с сотрудниками [29], где с помощью моноклональных антител к фитохрому изучали молекулярные механизмы участия фитохрома в фотоморфогенных ответах. [c.358]

Метод выделения и электрофореза белков для вестерн-блоттинга аналогичен тому, который используют для определения активности NPT-II (разд. 6.7). Если необходимы количественные результаты, то в каждом образце следует определить концентрацию белка по Брэдфорду (приложение 61III]) и провести электрофорез, нанеся на каждую дорожку известное количество белка. В предварительных экспериментах с тотальными белковыми экстрактами количество белка, наносимого на гель, должно быть относительно велико — 500—1000 мкг на дорожку. Методика, приведенная здесь, начинается с того, что берут промытый полиакриламидный гель, содержащий разделенные белки. [c.361]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

После окончания электрофореза для освобождения от ДДС-Na пластину ПААГ вымачивают при комнатной температуре в течение часа в 0,15 М Na-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М Na I к 0,5% Тритона Х-100. Затем гель кладут на стопку фильтров, смоченных тем же буфером, но без Тритона Х-100, с верхней поверхности геля фильтровальной бумагой удаляют избыток влаги, кладут на него диазобумагу, затем несколько слоев сухой фильтровальной бумаги Whatman ЗММ , все это накрывают стеклом и прижимают грузом. За 1—2 ч при комнатной температуре, благодаря диффузии и вымыванию из геля поднимающимся вверх током жидкости ( блоттинг ) часть белков из геля переходит на ДБМ-бумагу и связывается с ней в тех местах, которые лежат непосредственно над белковыми полосами в геле. Эта техника подробнее была описана при рассмотрении методов электрофореза [Остерман, 1981]. [c.130]

Системы на основе с-тус-последовательностей. Мышиные моноклональные антитела 9Е10 к белку с-тус широко использу-К)тся в качестве иммунохимического реагента в клеточной биологии и белковой инженерии [165]. Эпитоп, распознаваемый антителами, который представляет собой последовательность из 11 аминокислотных остатков, может быть экспрессирован в составе различных белков и остается распознаваемым антителами. Эта аффинная метка используется в Западном блоттинге, для иммунопреципитации белков, в проточной цитометрии, а также для мониторинга экспрессии генов на уровне трансляции в бактериальных и эукариотических системах, в том числе, и для быстрой очистки рекомбинантных белков, которые могут быть закристаллизованы 166, 167]. Система часто используется для обнаружения рекомбинантных белков, но редко - для их выделения в чистом виде. [c.129]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология