Аффинная метка

Самоуничтожающиеся инактиваторы ферментов и аффинные метки [c.448]

Что такое аффинная метка Для чего ее используют [c.157]

При присоединении лиганда Г к белку спектр ЯМР последнего, полученный при частоте 100 МГц, изменяется. Наибольшим изменениям подвергается спектр протонного резонанса в области от -80 до - 160 Гц (относительно стандартного сигнала ДСС). Используя аффинную метку Г — аналог лиганда, ковалентно связывающийся с белком, — можно показать, что центром связывания в белке является остаток тирозина. [c.176]

Согласуется ли результат эксперимента с использованием аффинной метки с данными ЯМР Объясните ваш ответ. Если бы у вас была возможность снять для проверки правильности вашего ответа еще один спектр ЯМР, какой образец вы бы выбрали Почему [c.176]

Протонам ароматических колец обычно отвечают сигналы, расположенные в гораздо более низкопольной области, чем — 80 -г- - 160 Гц, где должен наблюдаться резонанс метиленовых и метильных групп (разд. 9.6). Таким образом, добавление аффинной метки затрагивает остаток (тирозин), который вряд ли дает сигнал в спектральной области от - 80 до — 160 Гц, где наблюдаются изменения при присоединении лиганда. (Правда, ситуация изменится, если модифицируется не ароматическое кольцо тирозина, а его /3-метиленовая группа, протоны которой могут давать сигналы в этой области. Сушествует опасность, что Ь связывается с другим участком, а не с Ь, поэтому имеет смысл снять спектр аффинно меченного белка. Если в области от — 80 до — 160 Гц при присоединении аффинной метки никаких изменений в спектре не происходит, то, скорее всего, Ъ не находится в центре связывания Ь. Если же, напротив, спектр меченого белка в этой области изменяется так же, как это происходит при связывании немодифицированного белка с Ь, то весьма вероятно, что L присоединяется в области активного центра, а его действие на молекулу белка сравнимо с действием Ь, даже если протоны тирозина не затрагиваются. [c.461]

Все аффинные метки, составленные из аминокислотных последовательностей, можно разделить на две группы. К первой группе относятся небольшие пептиды, которые оказывают минимальное влияние на основной белок. Такие метки не иммуно-генны, и во многих случаях не возникает необходимости их удаления из гибридных полипептидов. Влияние коротких последовательностей на свойства основных полипептидов зависит от первичной структуры метки и положения в полипептидной цепи рекомбинантных белков [157]. Вторая группа аффинных меток включает большие пептиды или белки. Их использование способствует повышению растворимости основного белка, однако [c.126]

Глютатион-8-трансфераза в качестве аффинной метки. Гибридные белки, содержащие в качестве аффинной метки последовательность глютатион-8-трансферазы (GST), могут быть очищены хроматографией на колонках с иммобилизованным глютатионом [178]. Гибридные белки в большинстве случаев растворимы в водных растворах, существуют в них в виде диме- [c.131]

Третьим широко используемым способом отбора является введение аффинной метки в активный центр фермента в составе фаговой частицы с последующим отбором меченых частиц. Разновидностью этого подхода является использование субстрата, метаболизируя который, фермент совершает самоубийство, так как в результате ферментативной активации субстрат необратимо модифицирует активный центр фермента. [c.347]

Было разработано несколько аффинных меток. Среди них - глутатионтрансфераза, белок, связывающий мальтозу, и короткие аминокислотные последовательности - антигенные детерминанты, которые связываются соответственно с глутатионом, мальтозой и специфическими антителами. Использовали и разные сайты расщепления, специфичные для тромбина, энтерокиназы и других протеиназ. Аффинная метка и сайт расщепления могут находиться как на N-, так и на С-конце рекомбинантного белка и использоваться в прокариотических системах экспрессии, а также в системах экспрессии на основе клеток насекомых, млекопитающих или грибов. [c.149]

Аффинная метка или, иначе говоря, необратимый ингибитор активного центра, представляет собой химически активное соединение, близкое по своей структуре к субстрату. Это соединение специфически связывается с активным центром фермента и [c.244]

Поскольку связывание субстрата с ферментом является специфичным, скорость химической реакции, протекающей в пределах фермент- субстратного комплекса, чаще всего достаточно высока благодаря энтропийному преимуществу ее над простой бимолекулярной реакцией в растворе. Следовательно, соединения, которые обычно обладают низкой реакционной способностью, могут стать очень реакционноспособными аффинными метками. [c.245]

Принципы метода можно проиллюстрировать на примере одного из первых экспериментов по введению аффинной метки — реакции Ы-тозил-ь-фенилаланинхлорметилкетона (ТФХК) с а-химотрипсином [314]. [c.449]

Для вьщеления специфических гетерологичных белков из клеточных экстрактов и из смесей секретируемых белков можно использовать разные подходы. Один из них основывается на присоединении к клонированному гену - без нарущения рамки считывания - сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой. Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор между промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффинной метки. В одном случае перед клонированным геном был встроен - без нарущения рамки считывания - сегмент ДНК, кодирующий щесть остатков гистидина (Hisg), спейсерный участок, кодирующий семь аминокислот, и сайт [c.149]

Следующим примером является одностадийное выделение пептидов, несущих аффинную метку, из активного центра нук-леазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы [49]. [c.416]

Один из способов идентификации участков, выполняющих определенную функцию, основан на использовании аффинной метки (метки по сродству). При этом используют аналоги компонентов, которые связываются с рибосомой. Эти соединения либо сами по себе химически активны, либо их можно активировать in situ. Например, можно использовать тРНК с подходящими модификациями таким путем можно идентифицировать рибосомные компоненты, на которые переносится метка. Сходный метод сводится к использованию соединений, способных в результате фотохимического активирования вызывать сшивки, что позволяет идентифицировать взаимодействующие компоненты. [c.112]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Полиаргининовая система. Полиаргининовые аффинные метки обычно содержат 5-6 остатков Arg и добавляются к С-кон-цам белков, экспрессирующихся в бактериальных клетках. В сочетании с хроматографией на SP-сефадексе такие последовательности позволяют достигать 95% чистоты рекомбинантного белка и 44% выхода [158]. Метка может быть удалена с помощью карбоксипептидазы В. Система используется для иммобилизации функциональных белков на плоских поверхностях с целью изучения их взаимодействия с лигандами, а также на слюдяных подложках, обычно применяемых при электронной сканирующей микроскопии. В настоящее время применяется не очень часто. [c.127]

Системы на основе с-тус-последовательностей. Мышиные моноклональные антитела 9Е10 к белку с-тус широко использу-К)тся в качестве иммунохимического реагента в клеточной биологии и белковой инженерии [165]. Эпитоп, распознаваемый антителами, который представляет собой последовательность из 11 аминокислотных остатков, может быть экспрессирован в составе различных белков и остается распознаваемым антителами. Эта аффинная метка используется в Западном блоттинге, для иммунопреципитации белков, в проточной цитометрии, а также для мониторинга экспрессии генов на уровне трансляции в бактериальных и эукариотических системах, в том числе, и для быстрой очистки рекомбинантных белков, которые могут быть закристаллизованы 166, 167]. Система часто используется для обнаружения рекомбинантных белков, но редко - для их выделения в чистом виде. [c.129]

Ни пептид S-Tag, ни 103-звенный полипептид, используемый в качестве аффинного сорбента, не обладают ферментативной активностью, однако после образования комплекса в последнем индуцируется рибонуклеазная активность. Это позволяет количественно оценивать эффективность исследуемых систем экспрессии. Однако епде большей чувствительностью и удобством в применении обладают системы, в которых S-белок ковалентно связан с флуоресцентными красителями или ферментами (например, с классической пероксидазой хрена). Такую систему можно эффективно использовать для идентификации рекомбинантного белка с помопдью вестерн-блоттинга и ее часто применяют одновременно со второй аффинной меткой. [c.130]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Реакция аффинной метки с ферментом начинается с образования обратимо связанного комплекса фремент—ингибитор, далее следует стадия ковалентной модификации фермента и, следовательно, необратимое ингибирование. Эта схема аналогична механизму Михаэлиса — Ментен, а потому при возрастании концентрации ингибитора должно наблюдаться насыщение. Решение кинетического уравнения для этого случая приведено в гл. 4 [уравнение (4.71)]. Для простого случая неравновесного связывания, за которым следует медленная сталия химического превращения, справедливо уравнение [c.245]

Все эти свойства в совокупности являются тестом на выяв-ние аффинной метки, модифицирующей в активном центре группу, ионизация которой контролирует активность фермента. Наличие кинетики с насыщением (п. г) показывает, что метка образует комплекс с ферментом, хотя это можно и не обнаружить, если /С] лежит в области концентраций, при которых ингибитор не растворяется. Конкурентное ингибирование субстратом (п. а) подтверждает, что связывание происходит в активном центре. Стехиометрическое соотношение 1 1 означает, что эта модификация является избирательной. Ценные данные позволяет получить анализ рН-зависимости различных параметров. Как отме- [c.246]