Белки рекомбинантные, очистка

Клонированные целлюлазные гены можно использовать в разных целях для облегчения очистки рекомбинантных белков с помощью связывающего целлюлозу домена для получения коммерческих продуктов (например, этанола) из целлюлозных отходов с помощью микроорганизмов, в которые встроены целлюлазные гены. [c.300]

Некоторые белки, синтезирующиеся в клетках в избыточном количестве, образуют нерастворимые частицы (тельца включения). После разрущения клеток их легко можно отделить от большинства других клеточных компонентов. Вначале исследователям не удавалось дезагрегировать выделенные тельца включения так, чтобы при этом не произошла необратимая денатурация белков, но позже были разработаны методы, позволяющие ренатурировать рекомбинантный белок и восстановить его активность. Ясно, что все эти дополнительные процедуры увеличивают стоимость процесса очистки. [c.367]

Какую стратегию вы бы выбрали для очистки рекомбинантного белка, секретируемого в культуральную среду [c.370]

Если предполагается использовать молочную железу в качестве биореактора , то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза является крупный рогатый скот, который ежегодно дает до 10 ООО л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько [c.433]

Выделение ДНК, синтез двухцепочечных ДНК, конструирование векторов, получение продуктов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), способы очистки рекомбинантных белков [c.535]

Очистка рекомбинантных белков, продуцируемых дрожжами [c.236]

Следует отметить также, что образование нерастворимых телец включения в бактериальных клетках в ряде случаев (например, при крупномасштабной наработке инсулина человека) является преимуществом, а не недостатком, поскольку тельца могут облегчать очистку рекомбинантных белков и защищать их от протеолитической деградации. [c.123]

Очистка рекомбинантных белков с использованием [c.124]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Для получения гетерологичных рекомбинантных белков с клонированной эукариотической комплементарной ДНК (кДНК) обычно используются прокариотические системы экспрессии. Однако в некоторых случаях эукариотические белки, синтезированные в бактериях, оказываются нестабильными или биологически неактивными. Кроме того, как бы тщательно ни проводилась очистка, конечный продукт может быть загрязнен токсичными веществами или веществами, вызывающими повышение температуры у человека и животных (пирогенами). Чтобы решить эти проблемы, для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использования в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии. Такие белки должны быть идентичны природным по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансля-ционных модификаций. [c.135]

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. erevisiae. Их генетика хорошо изучена, а кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. erevisiae было получено множество самых разных аутентичных белков. Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались носттрансляционной модификации, к тому же их выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков. [c.154]

В некоторых случаях при гиперпродукции рекомбинантных белков образуются как растворимые, так и нерастворимые продукты, что усложняет процедуру очистки. Например, при экспрессии в клетках Е. соН гена инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) человека мол. массой 7,6 кДа примерно 90% рекомбинантных молекул локализуется в периплазме, а 10% секретируется. Чтобы вьщелить растворимую и нерастворимую формы IGF-I из периплазмы, для солюбилизации нерастворимой формы in situ добавляли мочевину и дитиотрейтол до высоких [c.367]

При всех положительных качествах стерилизующей фильтрации через мембраны нельзя не отметить и недостатки этого способа, к которым относятся адгезия частиц к мембранам, неоднородность пор по диаметру ("абсолютных мембран по стерилизующей эффективности не существует, но стерильность может быть достигнута и достигается вследствие наложения других причин, например, адсорбции частиц на мембране), удержание части стерилизуемой дорогостоящей жидкости на мембране при фильтрации малых объемов ее, а также возможная селективная адсорбция ионов (чаще — катионов) из небольших объемов растворов, недостаточная или плохая смачиваемость мембран водой и др К тому же по-прежнему актуальной остается проблема вирусного загрязнения БАВ и очистки БАВ от вирусов Ситуация, связанная с очисткой биопродуктов от вирусов, обострилась еще и потому, что появилось сообщение о контаминации гормона роста человека, получаемого из гипофиза, "медленным вирусом болезни Крейтц-фельда-Якоба, и это на фоне возрастающей роли ретровирусов (включая ВИЧ) Как следствие — усилилась настороженность к препаратам из крови, гормонам, экстрагированным из тканей млекопитающих, рекомбинантным белкам, образуемым культивируемыми клетками животных Более того, ряд вирусов животных являются патогенными для человека (зоонозные вирусные инфекции) [c.256]

Рис. 159. Схема очистки рекомбинантного интерферо-Е1а с помощью моноклональных антител (МкАТ) 1 - диализат с интерфероном и другими бактериальными белками, 2 - интерферон, 3 - балластные белки, 4 - МкАТ, 5 -интерферон, связывавший с МкАТ, 6 - слабая кислота.

При использовании описанного выше метода лизиса клеток Е. oli из них высвобождаются белковые включения, которые, как правило, остаются в нерастворимой форме. Поскольку рекомбинантный белок находится в виде дискретных включений, его выделение из клеточного лизата само по себе может служить стадией очистки. Включения эти обладают достаточно высокой плотностью, и поэтому их можно выделять центрифугированием. Средний разхмер и плотность включений могут варьировать в зависимости от природы экспрессируемого белка [16]. Это подтверждается опубликованными данными о выделении включений при использовании разных скоростей центрифугирования (величина центробежного ускорения) от 500 до 12 000 g [1]). Обычно можно эмпирически определить скорость центрифугирования и время, необходимые для осаждения включений, такие, чтобы другие специфические белки оставались в надосадочной фракции. Типичный метод выбора оптимальных условий разделения выглядит следующим образом. [c.101]

Как показано на рис. 4.4, после выделения включения могут быть загрязнены различными примесями. Дальнейшую очистку можно осуществить путем отмывки включений растворами, солюбилизирующими примеси, но не рекомбинантный белок. Так, например, два основных примесных компонента, загрязняющих включения прохимозина, по всей видимости, — белки наружной [c.102]

Такие аналитические методы, как исследование кругового дихроизма и рентгеноструктурный анализ, могут быть использованы для определения конформации ренатурированных и растворимых рекомбинантных белков. Немногочисленные имеющиеся к настоящему времени данные обнадеживают. Например, спектры, полученные при исследовании кругового дихроизма ренатурировавшего прохимозина [53] и секретируемого клетками Е. oli гормона роста человека [42], существенно не отличаются от спектров природных белков. Был также получен в кристаллическом виде -глобин, продуцируемый клетками Е. соИ и включившийся в состав гемоглобина. Исследование дифракции рентгеновских лучей с разрешением 2,8 А выявило весьма небольшие различия между природным и мутантным рекомбинантным белками эти различия объясняют изменениями, возникающими при генноинженерных манипуляциях [23]. Хотя и существуют проблемы, связанные с очисткой эукариотических полипептидов, выделяемых из клеток Е. oli, такая система используется для получения ряда белков, используемых в медицине [1]. [c.134]

Рекомбинантные белки очищают так же, как и любые другие белки в бесклеточном экстракте. Методы очистки дрожжевых белков не отличаются от тех, которые используются для Е. oli (гл. 4). Работая с дрожжевыми системами, как правило, не приходится беспокоиться по поводу ренатурации денатурированного белкового продукта. В частности, мы не знаем ни одного примера секретируемого дрожжами белка, который не обладал бы ожидаемой биологической активностью. Для аналитических целей очистка секретируемых белков с помощью иммупоаффин-ной хроматографии представляется предпочтительной, по крайней мере по мнению первого автора данной главы. [c.236]

Одно из практических применений технологии рекомбинантных ДНК—получение медикобиологической продукции. Генная инженерия дает возможность получать в больших количествах белки, которые не могут быть выделены применением обычных методов очистки (интерферон, плазмино-ген-активирующий фактор) кроме того, с помощью рекомбинантных ДНК можно нарабатывать специфические белки человека для замены используемых в клинической практике аналогичных белков животных (инсулин, гормон роста). Достоинства обеих технологий очевидны. [c.46]

Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в растворимой форме является обеспечение секрети-руемого характера их экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в питательную среду [148]. Системы секреции у грамположительных и грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Получение рекомбинантных эукариотических белков в секретируемой форме высокотехнологично, поскольку значительно облегчает их очистку. Кроме того, у секретируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию, так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а следовательно, и более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную структуру. Примером эффективного использования секреторной системы Е. соН является получение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) в секретируемой форме [149]. В этой системе удавалось нарабатывать до 1 г рекомбинантного белка в 1 л бактериальной культуры. Секретируемая система экспрессии на основе грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa будет кратко рассмотрена ниже в разделе 5.1.1. [c.122]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Системы на основе с-тус-последовательностей. Мышиные моноклональные антитела 9Е10 к белку с-тус широко использу-К)тся в качестве иммунохимического реагента в клеточной биологии и белковой инженерии [165]. Эпитоп, распознаваемый антителами, который представляет собой последовательность из 11 аминокислотных остатков, может быть экспрессирован в составе различных белков и остается распознаваемым антителами. Эта аффинная метка используется в Западном блоттинге, для иммунопреципитации белков, в проточной цитометрии, а также для мониторинга экспрессии генов на уровне трансляции в бактериальных и эукариотических системах, в том числе, и для быстрой очистки рекомбинантных белков, которые могут быть закристаллизованы 166, 167]. Система часто используется для обнаружения рекомбинантных белков, но редко - для их выделения в чистом виде. [c.129]

Кальмодулин-связывающий пептид. Очистка гибридных белков, содержащих кальмодулин-связываюпщй пептид, была впервые описана в 1992 г. [169]. В ней используется 26-звенный пептид, заключенный в С-концевой последовательности киназы легкой цепи миозина скелетных мышц. Кальмодулин в присутствии ионов Са2+ обладает высоким сродством к этому пептиду. Прочность комплекса допускает промывку колонки при аффинной хроматографии в жестких условиях, что позволяет достигать высокой степени очистки целевого полипептида. Система особенно пригодна для очистки рекомбинантных белков из клеток Е. соН, поскольку их собственные белки не взаимодействуют с кальмодулином. При этом хроматографию можно проводить в присутствии восстанав-ливаюпщх агентов и детергентов в концентрациях до 0,1%. Эта аффинная последовательность позволяет вводить радиоактивную метку с помопдью у-[32Р] и протеинкиназы А, что используется для исследования белок-белковых взаимодействий [170]. Данную аффинную последовательность предпочтительнее вводить в С-конец исследуемого полипептида, поскольку его N-концевая локализация часто приводит к ингибированию трансляции. [c.130]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Использование дрожжевых систем экспрессии в биотехнологии и научных исследованиях. Крупномасштабный синтез рекомбинантных белков является одной из основных целей, для достижения которой конструируются системы экспрессии рекомбинантных генов в клетках дрожжей [255]. Синтезируемые рекомбинантные белки могут накапливаться в цитоплазме клеток, после чего их выделяют по традиционной схеме с использованием многостадийной очистки из бесклеточных экстрактов, получаемых после разрушения клеток. Популярными также являются системы, обеспечивающие секрецию рекомбинантных белков в культуральную среду. В этом случае секрецию можно обеспечить, например, включением в рекомбинантный белок аминокислотной лидерной последовательности препро-а-фактора S. erevisiae, которая направляет синтезируемые молекулы в секреторные гранулы [256]. [c.173]

Несмотря на то, что биологическое значение сплайсинга белков до сих пор остается невыясненным, сам он уже находит применение в биотехнологии. Имеются, по крайней мере, две области применения интеинов. При одном подходе используют мутантные формы интеинов, у которых произведена замена Asn —> Ala в С-концевой части, что делает возможным прохождение только первого этапа сплайсинга. В таких системах рекомбинантные белки, синтезируемые в виде гибридных полипептидов с модифицированным интеином, отщепляются с участием тиольной группы в результате внутримолекулярной реакции трансэтерифика-ции (рис. 40). В итоге происходит высокоспецифическое протео-литическое освобождение рекомбинантного белка от предшественника, что облегчает его последующую очистку. Причем в процессе такого освобождения могут быть получены а-тиоэфир- [c.312]

Мутационная замена Asn Ala в С-концевой части интеина блокирует последнюю стадию сплайсинга рекомбинантного белка (см. рис. 39), при конструировании которого нуклеотидная последовательность целевого белка 1 была объединена в коммерческом экспрессирующем векторе в одной рамке считывания с последовательностями нуклеотидов мутантного интеина и хитин-связыва-ющего домена ( BD) бактериальной хитиназы. Последний в рекомбинантном белке выполняет роль лиганда, взаимодействующего с иммобилизованным рецептором (хитином), что необходимо для очистки белка с помощью аффинной хроматографии после связывания хроматографическим носителем целевой белок вырезается из полипептида с помощью добавленного тиола (R-HS) в реакции межмолекулярной трансэтерификации, и образовавшееся производное может быть далее лигировано с пептидом, содержащим остаток a- ys. Таким образом, процесс EPL объединяет в себе две стадии тиолиз с участием интеина и спонтанное химическое лигирование нативных белков [c.314]

В исследовательской работе часто требуется оценивать скорость биосинтеза и содержание конкретных белковых молекул в живой клетке, следить за их перемещением во внутриклеточном пространстве или выделять труднодоступные белки в индивидуальном виде из сложной смеси. В этом случае белки-репортеры оказываются незаменимыми. Например, присоединив к С-концу анализируемого белка в качестве белка-репортера -галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности -галактозидазы или отслеживая ее антигенные детер- [c.382]

Смотреть страницы где упоминается термин Белки рекомбинантные, очистка: [c.131] [c.114] [c.174] [c.359] [c.413] [c.228] [c.165] [c.166] [c.5] [c.116] [c.122] [c.128] [c.128] [c.128] [c.129] [c.131] [c.132] [c.341] [c.379] [c.383]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология