Цитометрия проточная

Клеточная суспензия может быть использована как в виде живых интактных клеток, так и в фиксированном состоянии. Фиксированные клетки используются для дальнейшего окрашивания и последующего анализа проточной цитометрией. Наиболее часто используется фиксация этанолом. [c.201]

VI. Суспендируйте конечный осадок в растворе Хэнкса до концентрации 10 клеток/мл и анализируйте проточной цитометрией. [c.198]

Анализ клеток проточной цитометрией в жидкой среде требует совершенно иных методов окрашивания по сравнению с окраской клеток на стеклах. Суспензия должна состоять из одиночных клеток, флуоресцентные зонды или другие красители должны быть специфичны и не вымываться из клеток в среду, флуоресцирующие красители должны возбуждаться какой-либо из линий аргонового или криптонового лазера, и в том случае, когда предполагается сортировка жизнеспособных клеток, краситель не должен быть токсичным. [c.182]

Гистограммы производятся многоканальными анализаторами установок либо в форме двумерных гистограмм (рис. 6.8) (интенсивность флуоресценции против числа клеток), либо в форме трехмерных гистограмм (флуоресценция и светорассеяние против числа клеток). Если данные собираются одновременно с двух различных ФЭУ, то требуются более сложные многоканальные анализаторы. Трехпараметрические гистограммы могут также создаваться некоторыми компьютерами, откладывающими частоту распределения клеток по параметрам X, У и 2. Количество клеточных параметров, определяемых одновременно, характеризует оснащение установки для проточной цитометрии. [c.195]

Проточная цитометрия регистрирует один или более сигналов от каждой индивидуальной частицы, проходящей через световой луч. Следовательно, клетки суспендируют до одиночных, и в суспензии не должно содержаться агрегатов или клеточных обломков. Краситель должен быть специфичным и не вытекать из клеток в среду. [c.197]

Как следует из самого названия этого метода, проточная цитометрия опирается на измерения некоторых свойств клеток в проточной системе . Проточная система состоит из специальным образом создаваемого потока жидкости, в который вво- [c.326]

III. Проведите анализ на проточном цитометре в течение 10 мин после добавления раствора Б. [c.205]

IV. Анализируйте в проточном цитометре с аргоновым лазером при линии возбуждения 488 нм и эмиссией флуоресценции в диапазоне 515—555 нм. [c.207]

Функционирование иммунной системы обеспечивается клетками многих типов. Совершенно очевидно, что понимание процессов иммунного ответа требует знания того, какие клетки принимают в них участие и взаимодействуют друг с другом. Один из подходов к изучению иммунной системы, которому отдавалось предпочтение в последние несколько лет, состоял в применении клонального анализа, например методов лимитирующих разведений с использованием клональных клеточных линий. Другой подход, который ни в коей мере не подменяет клональный анализ, а скорее дополняет его, заключается в определении гетерогенности популяций по экспрессируемым маркерам клеточной поверхности. В рамках этого второго подхода весьма популярными стали методы проточной цитометрии и сортировки клеток. [c.326]

Задачей проточной цитометрии являются идентификация субпопуляций клеток, определение частоты их встречаемости и получение различных количественных характеристик субпопуляции. Например, при окрашивании спленоцитов антителами против иммуноглобулинов можно отличить клетки с поверхностными иммуноглобулинами от клеток, не содержащих поверхностных иммуноглобулинов определить число клеток каждой из таких субпопуляций выяснить, как много иммуноглобулинов находится на клеточной поверхности (в относительных или абсолютных величинах). [c.326]

В блоке обработки поступающие от детектора сигналы усиливаются, сравниваются на основе выбранных критериев и в зависимости от результатов сравнения производят одно из двух описанных ниже действий, оба эти действия сразу или не производят ни одного из них 1) сигнал посылается на оптическую скамью и клетка отбирается 2) зарегистрированные параметры для клетки посылаются в блок сбора данных. В большинстве проточных цитометров процессинг инициируется, когда сигнал светорассеяния превышает фон на определенное пороговое значение. Поскольку клетки большинства типов дают интенсивный сигнал светорассеяния, включение процессинга по светорассеянию обеспечивает регистрацию данных для всех жизнеспособных клеток. Это важно для оценки доли позитивно или негативно окрашенных клеток в популяции. [c.329]

В различных лабораториях образцы для проточной цитометрии готовят по-разному. К тому же из-за все возрастающего разнообразия областей применения цитометрии (например, для определения потенциала мембран или анизотропии эмиссии) способы окраски клеток также сильно различаются. В данной главе рассматриваются методы приготовления препаратов, предназначенные для окрашивания поверхности клеток традиционными реагентами, какими являются антитела. [c.334]

При исследовании того или иного образца на проточном цитометре следует заранее четко определить, какие параметры будут измеряться, как будут дискриминироваться данные и какое будет использовано усиление. [c.340]

Многие проточные цитометры оборудованы усилителями двух типов — линейными и логарифмическими. Режимы работы этих усилителей описаны ниже. [c.343]

Основной формой анализа результатов проточной цитометрии является обработка данных по одному параметру. Иногда экспериментатор заинтересован в одновременном анализе нескольких параметров, но обычно ему приходится проводить обработку данных только по одному из них. При таком анализе окрашенной н контрольной проб возникает ряд вопросов. 1) Какую долю клеток в популяции можно считать окрашенной по сравнению с уровнем фона 2) Сколько субпопуляций клеток четко выявляется в пробе 3) Какую долю общего числа клеток составляет каждая субпопуляция 4) Какова интенсивность сигнала по регистрируемому параметру для каждой субпопуляции [c.347]

Разделы сборника, посвященные методам элютриации и проточной цитометрии, заинтересуют в первую очередь исследователей, работающих в области молекулярной биологии клетки. Эти два новых метода хотя и требуют дорогостоящего оборудования, но зато позволяют получать принципиально новые результаты. При чтении главы о проточной цитометрии особое внимание следует обратить на возможные сферы применения этого метода сравнительный анализ ответов индивидуальных клеток на те или иные воздействия и отбор индивидуальных клеточных популяций, идентичных по тому или иному параметру. В настоящее время, когда появляется все больше данных о гетерогенности клеток в тканях и даже в клеточных культурах, использование проточной цитометрии в сочетании с современными методами клонирования клеток сулит весьма увлекательные перспективы. [c.5]

Аналитическое и препаративное фракционирование клеток рассмотрено в двух главах, посвященных проточной цитометрии н элютриационному центрифугированию. Методы анализа на клеточном и субклеточном уровнях приведены в главе, посвященной гибридизации in situ. В главе, посвященной органной культуре, подчеркнуто значение клеточных взаимодействий и сохранения гистологической структуры ткани и приведены стандартные методы ведения органной культуры. Наконец, в главе, посвященной определению жизнеспособности клеток и оценке цитотоксичности, рассматриваются проблемы токсикологии и скрининга противоопухолевых препаратов, а также стандартные методы оценки выживаемости клеток в культуре. [c.7]

Чрезвычайно эффективной альтернативой седиментацион-ным методам разделения клеток является электронная сортировка клеток, меченных моноклональными антителами к поверхностным маркерам [гл. 6]. В качестве примера можно привести исследования Ватта с сотрудниками [И], описавших дифференциальное связывание двух моноклональных антител с кроветворными клетками. При последовательной обработке этими антителами удалось выделить с помощью проточной цитометрии популяцию клеток, на 60% обогащенную эритроид-ными предшественниками. Этот метод обеспечивает получение небольшого количества клетак за короткий промежуток времени по сравнению с методом элютриации. Аппаратура для сортировки клеток требует больших материальных затрат как при приобретении, так и при эксплуатации. [c.168]

Рис. 5.5. Кривые проточной цитометрии клеток HL60. На первом рисунке показана кривая для асинхронно делящихся клеток, а на последующих — кривые для различных фракций, выделенных при указанных скоростях протока.

Чтобы отличить клетки в S-фазе от клеток, находящихся в других фазах цикла, можно использовать включение тимидина, меченного тритием, в ДНК с последующим выявлением изотопа (радиоавтографией или с помощью сцинтилляционпого счетчика). Однако в настоящее время наиболее точный и полный анализ разделяемых клеток может быть проведен с помощью проточной цитометрии (см. гл. 6). [c.178]

Профиль проточной цитометрии для асинхронно делящихся клеток HL60 приведен на рис. 5.5. Этот профиль типичен для постоянных линий клеток, хотя клетки HL60 гетерогенны по содержанию ДНК. 2-10 таких клеток были загружены в ро- [c.178]

Для оценки жизнеспособности разделяемые эритролейкозные клетки в фазе G1 могут быть культивированы в элютриаци-онном буфере (полная среда) при 37,5 °С. Через различное время культивирования отбираются пробы для анализа в проточном цитометре. Получаемые профили (рис. 5.6) свидетель- [c.179]

Проточная цитометрия — это относительно новый метод, позволяющий оценивать несколько оптических параметров для каждой частицы в суспензии, например оптическую плотность, флуоресценцию и светорассеяние определять их можно как поодиночке, так и все сразу. Каждое измерение проводится за несколько микросекунд это обеспечивает сбор данных на большой популяции частиц. Возможность анализа оптических параметров частиц позволяет осуществлять их сортировку в сложных смесях по одному или более измеряемым параметрам. Методом сортировки можно характеризовать клеточную попу-.1ЯЦИЮ по светорассеянию — одному из параметров, дающему информацию об объеме или площади поверхности клеток. Два других обычно оцениваемых параметра — это оптическая плотность и флуоресценция. [c.182]

В некоторых упрощенных установках более дорогие лазеры заменяются дуговыми лампами. Однако, несмотря на большее число спектральных линий, эти установки с дуговым освещением оказываются менее чувствительными. Размер компьютера и программное обеспечение являются другими факторами, ограничивающими применение проточных цитометров. Следует подчеркнуть, что нужно тщательно продумывать список комплектующего оборудования. Кроме цены выбор того или иного набора оборудования определяет пригодность установки к проведению определенного типа анализа или сортировки. Некоторые установки могут быть прекрасно приспособлены для мно-гопараметрического анализа, но непригодны для сортировки клеток и наоборот. [c.183]

III. Отделите ядра путем многократного пипётирования н проанализируйте проточной цитометрией. [c.203]

III. После окрашивания пропустите клетки через проточный цитометр, возбуждаемый ртутной лампой (100 Вт) с запирающим фильтром В012 (3 мм) и одиночным фильтром К590. [c.204]

V. Для анализа методом проточной цитометрии ресуспендируйте жлетки в холодной среде МЕМ до (концентрации 1-10 клеток/мл выдерживайте их на холоду до анализа [73, 74]. [c.209]

В распоряжении исследователя, использующего проточную цитометрию, имеется большой выбор инструментов. Инструменты сходны, но не идентичны, поскольку каждый из них приспособлен для определенного типа экспериментов. Характеристиками приборов являются источники возбуждающего света, чувствительность фотоумножителей и компьютерная обработд<а. [c.209]

Все эти недостатки метода изложены на основе нашего собственного опыта работы. Перспективы проточной цитометрии и сортинга клетак хорошо известны каждому ученому, н энтузиазм в связи с новыми возможностями, предоставляемыми этой техникой, приводит к недооценке сложностей и ограничений, присущих технологии в целом или типу используемого оборудования. [c.210]

С помощью разделяющих пучок зеркал, а также дихроиче-ских и обычных зеркал в большинстве проточных цитометров удается измерять одновременно несколько флуоресцентных сигналов. Показания детектора зависят от свойств света, достигающего его (цвета или длины волны). Избираемый цвет в свою очередь обусловлен флуорохромом. [c.329]

Хотя вопросы очистки и мечения связывающихся с лигандами молекул достаточно подробно обсуждались другими авторами (L. Forni Immunologi al Methods , v. 1), здесь следует отметить некоторые моменты, имеющие значение для проточной цитометрии. [c.332]

Стандартным флуорохромом, применяемым в проточной цитометрии, стал флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) благодаря тому, что он обладает многими из перечисленных выше свойств, а также тому, что он доступен. Самым серьезным недостатком -ФИТЦ является то, что клетки некоторых типов (например, клетки, культивированные in vitro) интенсивно флуоресцируют в области эмиссии ФИТЦ, и то, что квантовый выход для ФИТЦ невелик. Тем не менее с ФИТЦ удобно работать, и в большинстве случаев для него характерны высокие отношения сигнал/фон. [c.333]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология