Реакция лигирования

При трансформации Е. oli рекомбинантными плазмидами — продуктами реакций лигирования — важно поставить контрольные опыты по трансформации как для установления эффективности трансформации используемых компетентных клеток, так и для проверки надежности селекции и методик скрининга. Как указывалось ранее в разд. 1.6, при использовании для трансформации лигированных смесей, а не интактных плазмид, обычно ставят другие контроли, чтобы следить за эффективностью лигирования с образованием кольцевых гетеродимеров и других продуктов реакции (табл. 1.4). В табл. 1.5 приведены результаты типичного эксперимента по лигированию и трансформации. [c.62]

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

В этом случае реакция лигирования имеет биохимические особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. [c.117]

Соединение фрагментов по тупым концам. Тупые концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз, производящих прямой разрез внутри сайта рестрикции, также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность на порядок ниже, чем при сшивке по липким концам. Однако преимущество соединения фрагментов с тупыми концами по сравнению с липкими 6 том, что не имеет значения, какие рестриктазы образовывали эти тупые концы фрагменты, образованные в результате действия разноименных рестриктаз, легко соединимы (рис. 1.5). [c.34]

Удаляют супернатант, высушивают под вакуумом и ресуспендируют в соответствующем объеме НгО перед использованием в реакции лигирования (разд. 1.6). [c.50]

Осадок высущивают под вакуумом, а затем ресуспендируют в соответствующем объеме НгО для добавления в реакцию лигирования (разд. 1.6). [c.54]

РНК-лигаза катализирует ковалентное связывание одноцепочечных ДНК или РНК, при условии, что они содержат концевые З -ОН- и 5 -Р0<,-группы. Молекулы, содержащие З -ОН-группы, принято называть акцепторными, а 5 -Р04—донорными. В роли доноров выступают олигонуклеотиды и двухцепочечные ДНК. Минимальными донорами могут быть нуклеозид 3, 5 -дифос-фаты pNp и pdNp. Полирибонуклеотиды более эффективны в качестве акцепторов, чем полидезоксирибонуклеотиды. Трииуклеозид-дифосфаты NpNpN—ОН являются минимальными акцепторами. Эта реакция лигирования иллюстрируется схемой. [c.353]

Реакции лигирования проводят обычно в объеме 10 мкл, для чего требуется брать по несколько десятых микрограмма ДНК. Если данные о концентрации и качестве ДНК неопределенны, то рекомендуется экспериментально наРги оптимальное соотношение концентраций лигируемых молекул. Это замечание тем более справедливо для клонирования с использованием X векторов, no KOjib-ку в реакции лигирования присутствуют два его плеча. В этом [c.243]

Чтобы получить максимальный выход нужных кольцевых гетеродимеров, важно, чтобы немодифицированная вставка присутствовала в реакции лигирования в правильном соотношении / г. Поскольку вектор модифицирован щелочной фосфатазой, он может быть лигирован только с немодифицированными концами [c.56]

Примечание Фрагменты ДНК, полученные с помощью этого метода, не содержат ингибирующих примесей, и их можно использовать во всех ферментативных реакциях (например, в реакциях лигирования, ник-трансляции и т. д.). [c.81]

Почему реакцию лигирования ведут при пониженных температурах [c.187]

При увеличении числа олигонуклеотидов, вводимых в реакцию лигирования на стадии об- [c.64]

I Освобождение АТР из комплекса с ферментом сопря- жено с самой реакцией лигирования. Если эта реакция протекает по тому же пути, что и ранее описанная реакция РНК-лигазы Т4, она будет включать два этапа. [c.319]

Для контроля очень полезно на каждой стадии отбирать небольшие аликвоты (2—5% объема) и подвергать их электрофорезу в 1,4%-ном агарозном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозу или полиамид и блот-гибридизацией с 8ирР-теяоы. В случае успешной реакции циклического лигирования ДНК гена зирР будет давать полосы в виде лестницы, и небольшое ее количество должно оказаться в той зоне геля, которая соответствует высокомолекулярной ДНК (что свидетельствовало бы о реакции лигирования с геномной ДНК). После обработки рестриктазой соН1 лесенка зирр-гена должна остаться, а полосы из высокомолекулярной области должны расщепиться на множество фрагментов размером от 1 до 20 т. п. н. [c.107]

ДНК-лигазы ведут эту реакцию на разных субстратах, связывая даже дезоксирибо- и рибонуклеотидные цепи. Фаговая лигаза может объединить и две рибонуклеотидные цепочки, действуя как РНК-лйгаза, но в отличие от последней она работает только на матрицах. Возможными матрицами в реакциях лигирования выступают комплементарные нити ДНК или РНК. [c.175]

Важной особенностью данного подхода является то, что в капсид преимущественно упа-швываются молекулы фаговых ДНК, имеющие размер, близкий к размеру фагового генома. Это позволяет после реакции лигирования фрагментов осуществлять селекцию гибридных молекул ДНК in vitro по размеру. Кроме того, в капсиды не упаковываются многочисленные побочные продукты лигазной реакции. Поэтому образовавшиеся после упаковки фаговые частицы инъецируют в бактериальные клетки лишь [c.84]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология