Рестрикционное картирование

Ключом к рестрикционному картированию служат свойства одного класса ферментов, обнаруженных у бактерий (более детально эти ферменты рассматриваются в гл. 34 в связи с их естественным распространением). Мы уже говорили, что рестриктирующие ферменты режут двухцепочечную ДНК в специфических участках. Каждый рестриктирующий фермент имеет свою особую мишень. Обычно это специфическая последовательность нуклеотидов длиной от 4 до 6 пар оснований. Фермент режет ДНК в каждой точке, где встречается такая последовательность. Разные рестриктирующие ферменты имеют различные последовательности-мишени. Сейчас в распоряжении исследователей находится большой набор рестриктаз. (Их применение детально описано в гл. 19.) [c.44]

Использование перекрывающихся фрагментов-это ключ к рестрикционному картированию. Рассмотрим для примера уже известный нам фрагмент в 1900 п.н. Он образуется либо в результате обработки фрагмента А-2100 ферментом В, либо после обработки фрагмента В-2500 ферментом А. Из данных о расщеплении фрагментов А-2100 и В-2500 мы знаем, что с одной стороны на расстоянии 200 п.н. от фрагмента 1900 находится следующий А-сайт, а с другого конца, на расстоянии 600 п.н.,-следующий В-сайт. На основе этих данных мы можем нарисовать карту, указав на ней вертикальными линиями сайты рестрикции ферментами А и В и размеры фрагментов между ними. [c.45]

Некоторые тонкости рестрикционного картирования [c.45]

Чтобы сопоставить рестрикционную и генетическую карты, нужно сравнить рестрикционные карты ДНК дикого типа и соответствующих мутантов. Связь между генетической и физической картами можно установить на основе одного рестрикционного картирования, если имеются мутанты, сильно изменяющие генетическую карту. Например, маленькая делеция или вставка, нарушающая генетическую карту, вызовет соответственно уменьшение или увеличение размера того рестрикционного фрагмента, в котором она находится. Более протяженная делеция (или вставка) может удалять (или вводить) серии рестрикционных сайтов. Такой пример разобран на рис. 3.4. [c.46]

До сих пор мы рассматривали определение последовательностей в случае определенных, но коротких фрагментов ДНК. А как перейти к определению нуклеотидной последовательности длинных молекул Так же как и при рестрикционном картировании, метод состоит в использовании перекрывающихся фрагментов. Предположим, что у нас есть серия последовательных фрагментов, расположенных следующим образом [c.51]

Фрагмент чужеродной ДНК может быть встроен в плазмиду в любой ориентации, т.е. любой его конец может быть соединен с любым концом плазмиды. Это не имеет значения, когда цель клонирования состоит просто в амплификации встроенной последовательности. Однако ее ориентация может оказаться существенной, когда эксперимент проводится с целью получения экспрессии чужеродной ДНК. В этом случае в результате случайных встраиваний могут быть получены популяции плазмид, ориентированных и в том, и в другом направлении, после чего путем рестрикционного картирования выявляется нужный класс. Можно также провести эксперимент таким образом, чтобы встраивание осуществлялось только в одной ориентации. Например, обе ДНК, векторная и встраиваемая, могут быть разрезаны двумя рестриктазами, образующими разные липкие концы, так что каждая молекула ДНК будет иметь такую структуру [c.241]

Рестрикционное картирование прерывистых генов [c.248]

Как при получении фрагментов прерывистого гена можно быть уверенным в том, что обнаружены все интроны и все экзоны Структуру гена устанавливают анализом перекрывающихся фрагментов, соответствующих различным его областям. Это общий принцип рестрикционного картирования и определения последовательности ДНК (описанных в гл. 3), и вероятность пропуска части гена в данном случае будет исключена. [c.251]

Любой сегмент локуса w, полученный в таком клоне, может быть использован для выделения всего локуса с помощью метода прогулка по хромосоме , который представляет собой усовершенствованный вариант рестрикционного картирования. Он основан на использовании перекрывающихся фрагментов, полученных в результате разрывов генома в одной и той же области. Принцип метода иллюстрирует рис. 37.5. [c.477]

Диабет И-это широко распространенное заболевание, которое проявляется в среднем возрасте и при старении, но обычно в мягкой форме. Генетические факторы здесь играют важную роль, о чем свидетельствует высокая степень конкордантности монозиготных близнецов. Природа генетических факторов и тип наследования еще не установлены. Результаты некоторых исследований с использованием рестрикционного картирования инсулинового гена говорят о том, что у больных диабетом II чаще обнаруживаются гипер-вариабельные участки в 5 -фланкирующей области в непосредственной близости к инсулиновому гену. Заметим, однако, что эти результаты еще не подтвердились. [c.295]

Все делеции можно выявить как до, так и после рождения с помощью рестрикционного картирования. Описаны различные фенотипы, наблюдающиеся при делециях одного, двух, трех и четырех генов а (табл. [c.96]

Глава 5. ФИЗИЧЕСКОЕ (РЕСТРИКЦИОННОЕ) КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛ ДНК [c.154]

ДНК, клонированную в фаге Я, можно перенести в плазмидный вектор. Так как размер плазмидного вектора меньше размера вектора Я, то многие методики рестрикционного картирования и определения нуклеотидных последовательностей в этом случае значительно упрощаются. [c.52]

Описаны методы трансфекции эукариотических клеток рестрикционное картирование технология больших молекул ДНК выявление единичных замен нуклеотидов в ДНК проведение полимеразной цепной реакции получения ДНК генная дактилоскопия. [c.4]

Физическая карта (Physi al map) Расположение генов на хромосоме, установленное с помощью различных методов (электронная микроскопия, секвенирование, рестрикционное картирование). Расстояние на такой карте измеряется в числе пар нуклеотидов. [c.563]

Подробную рестрикционную карту можно связать с генетической картой. Крупные генетические изменения, такие, как делеции или вставки, можно обнаружить методом рестрикционного картирования. Они приведут к уменьшению или увеличению соответствующих рестрикционных фрагментов. Кроме того, иногда в разультате генетиче- [c.46]

Вначале предполагали, что мРНК должна иметь такую же последовательность оснований, как ДНК, с которой она транскрибирована. Для доказательства того, что выделенная из генома последовательность ДНК действительно совпадала с последовательностью мРНК, использованной для ее выделения, их нуклеотидные последовательности сравнивали с помощью как электронной микроскопии, так и рестрикционного картирования. Но выявлены были как раз различия между их нуклеотидными последовательностями, заключающиеся в наличии дополнительных участков, присутствующих в ДНК генома, но отсутствующих в мРНК. [c.246]

Рестрикционное картирование как мРНК, так и геномной ДНК наиболее легко осуществить, используя клонированные последовательности. Разумеется, при ра- [c.248]

При картировании с использованием нескольких рестриктаз могут быть получены результаты и того, и другого типа. Разрывы, вносимые одними ферментами, не попадают в промежуточную последовательность тогда длина соответствующих фрагментов увеличивается. При использовании других ферментов из той же промежуточной последовательности будут образовываться дополнительные фрагменты. Объединяя вместе эти данные, мы видим, что при создании полной рестрикционной карты гена, содержащего интроны, карта каждого конца гена соответствует карте каждого конца последовательности мРНК. Но в некоторой точке внутри гена карты различаются там имеется дополнительная область, содержащая ряд сайтов узнавания, отсутствующих в мРНК. Разрешающая способность метода рестрикционного картирования позволяет обнаруживать участки гена размером до 20-30 п. н. [c.249]

Наблюдается значительная дивергенция между отдельными Ту-элементами. Большинство из них попадает в один из двух основных классов, получивших название Ту1 и Ту917. Их взаимосвязь показана на рис. 37.1. Элементы обоих классов фланкированы дельта-повторами. Общим в их структуре является также присутствие длинных областей в левом конце, в середине и короткой области, прилегающей к правой дельта-последовательности. Судя по результатам рестрикционного картирования и гетеро дуплексного анализа, две основные области замещения не проявляют гомологии. Отдельные Ту-элементы каждого класса могут отличаться от своего прототипа одним или несколькими основаниями, вставками или делециями. Значительная гетерогенность характерна и для 5-последовательностей, хотя более вероятно, что оба повтора одного Ту-элемента идентичны или по крайней мере очень близки, (Самый выраженный случай дивергенции соответствует шести различиям в 330 парах оснований). Не известно, чем обусловлена идентичность терминирующих последовательностей 5-элементов конверсией. [c.473]

Техника рекомбинантной ДНК позволила проанализировать тонкую структуру гена white методом рестрикционного картирования его ДНК. [c.182]

Со5-картирование разработали Раквиц и др. [21] для картирования клонов фага к. Эта процедура используется также и в случае космидных клонов [6]. Основная проблема, возникающая при анализе космидных клонов путем рестрикционного картирования, связана с их размером у них слишком много сайтов для наиболее широко используемых ферментов, чтобы осуществить быстрое картирование. Со5-картирование обходит эту трудность, используя частичный рестриктазный гидролиз для идентификации сайтов и определения порядка их распределения. Схематично этот процесс показан на рис. 2.2. Левый или правый липкие концы метят, подвергая их отжигу с меченным P 12-членным фрагментом ДНК, комплементарным левому или правому липкому концу фага К. Затем ДНК подвергают частичному рестриктазному гидролизу, а радиоактивные фрагменты путем определения стартового участка обнаруживают радиоавтографией после фракционирования их по размеру в-агарозном геле. При этом выявляются все фрагменты с меченым концом. [c.63]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Благодаря развитию методов рестрикционного картирования и секвенирования молекул ДНК удалось установить, что во многих генах эукариот между экзонами (т. е. кодирующими фрагментами последовательности) располагаются протяженные участки ДНК, не несущие генетической информации, непосредственно транслируемой в аминокислотную последовательность белков (см. гл. 38). Такие промежуточные последовательности, или интроны, обнаруживаются в большинстве, но не во всех генах высших эукариот. Первичные транскрипты структурных генов включают и участки, соответствующие нитронам. В ходе процесса, называемого сплайсинг , эти участки первичного транскрипта точно вырезаются, а соответствующие экзоны—сшиваются. Процесс протекает в ядре, затем сформировавшиеся молекулы мРНК выходят в цитоплазму, где и происходит их трансляция (рис. 39.9). [c.88]

В начале 80-х годов стало очевидно, что современкому генному инженеру компьютер необходим не менее (а иногда и более) чем физи ку, химику или экономисту. Возникла необходимость в создании автоматизированного рабочег о места генног о инженера. При этом выявилось, что ряд задач, возникающих у генных инженеров, связан с анализом огромного количества вариантов. Такие задачи не поддаются решению при помощи "лобовых подходов, для их анализа необходимо применение методов современной дискретной математики. Одна из та ких задач физическое (рестрикционное) картирование молекул ДНК -рассматривается в гл. 5 (Певзнер П.А.). Физическое картирование -один из самых распространенных методов анализа ДНК. В связи с предполагаемым ссквенированием генома человека объем работ по физическому картированию в ближайшие годы будет значительно увеличен. В настоящее время физическое картирование - один из разделов компьютерной генетики, где удалось "заставить" работать серьезные результаты из разных областей математики (теория графов, потоки в сетях, эргодическая теория). [c.7]

Предлагаемый вниманию читателей сборник Анализ генома ПОД редакцией К. Дейвиса — еще одна книга из прекрасно зарекомендовавшей себя серии А Pra ti al Approa h . В ней описаны новейшие молекулярно-биологические методы переноса генов в клетках млекопитающих, рестрикционного картирования, конструирования библиотек прыжков , полимеразной цепной реакции и др. Иными словами, в эту книгу включены те методы, которые позволяют существенно продвинуться в понимании структуры и функционирования генома, разобраться в механизмах наследственных болезней человека. Особого внимания заслуживает материал, изложенный в двух последних главах. Одна из них (гл. 7) посвящена геномной дактилоскопии, методу, перевернувшему представления о возможностях судебно-медицинской экспертизы в другой (гл. 8) речь идет о картировании генов, ответственных за некоторые наследственные болезни человека, с помощью анализа ПДРФ-маркеров. Как всегда в книгах этой серии непосредственному описанию каждой методики предшествует краткое теоретическое введение, делающее ее понятной и начинающему аспиранту, и опытному исследователю. [c.5]

Процедуры получения ДНК из культивируемых клеток и из простейших имеют много общего. Для рестрикционного картирования необходимо использовать клеточные линии только с нормальным стабильным геномом. Например, клетки HeLa очень удобны для культивирования, но содержат большое количество хромосомных перестроек и имеют разную плоидность. Один миллион диплоидных клеток должен содержать примерно 6,6 мкг ДНК, что соответствует размерам генома 6X10 нуклеотидных пар. Поскольку несинхронизированные клеточные культуры обычно представляют собой смесь диплоидных, тетраплоидных и промежуточных состояний, мы используем для работы 1X10 клеток, считая, что они содержат примерно 10 мкг ДНК. [c.68]

Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь рестрикционную карту такой клонированной вставки ДНК. Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1—2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования [24]. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов (см. разд. 5.1) или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов (см. разд. 6.3 и рис. 10). После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2—3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте. [c.141]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология