Физическое картирование ДНК

Рис. 11.13. Физическое картирование молекулы ДНК методом неполного гидролиза (Л) и методом двух рестриктаз Б) (по Н. И. Матвиенко, 1979). Фрагменты А, В, С образуются при действии рестриктазы I А, В — при действии рестриктазы II

Физическое картирование бактериальных генов методом прерванной конъюгации [c.236]

Физическое картирование генома человека [c.462]

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276]

РЕСТРИКЦИОННЫХ КАРТ (ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ) [c.27]

Конечно, зная нуклеотидную последовательность, легко построить физическую карту по каждой рестриктазе - для этого нужно просто найти все вхождения сайта узнавания этой рестриктазы в последовательность ДНК. Однако, если последовательность ДНК неизвестна (или известна не полностью), то физическое картирование превращается в довольно трудоемкую процедуру, требующую как проведения биохимических экспериментов, так и применения специальных математических методов построения физических карт по косвенным биохимическим данным. При этом размеры фрагментов определяются с помощью биохимических методов, а вот восстановление порядка расположения фрагментов требует привлечения методов дискретной оптимизации и ЭВМ. [c.155]

Уточнение физических карт. При реализации алгоритмов физического картирования на первый план выдвигаются следующие две задачи [c.159]

Исходной информацией для физического картирования являются упорядоченные множества положительных чисел [c.177]

Певзнер П.А. Задача о минимальном в среднем цикле и физическое картирование молекул ДНК//Дискретная оптимизация и компьютеры Тез. докладов III Всесоюзной школы-семинара, М.,1987.С.200-201. [c.245]

Если физическое картирование сделано для участка генетического материала, маркированного мутациями с известным расположением, то рестрикционную (физическую) и генетическую карты можно ориентировать относительно друг друга (см. гл. 16). [c.284]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции некоторых, например, повторяющихся последовательностей. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул, которые являются одной из главных проблем, возникающих при использовании YA 40-60% клонов могут содержать химерные молекулы. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов. [c.92]

В ряде случаев для секвенирования или анализа больших участков эукариотических генов необходимо иметь набор делеций, которые начинаются в общей точке и простираются в анализируемую область на разную длину. Это позволяет не проводить физическое картирование и секвенировать ее с использованием общего [c.264]

Рестриктазы II типа очень широко испатьзуются в методах генной инженерии для физического картирования ДНК и для выделения участков ДНК в составе того или иного рестрикционного фрагмента. Поэтому в течение ряда лет велся широкий поиск рестриктаз [c.130]

Рестриктазы II типа очень широко испачьзуются в методах генной инженерии для физического картирования ДНК и для выделения участков ДНК в составе того или иного рестрикционного фрагмента. Поэтому в течение ряда лет велся широкий поиск рестриктаз II типа с разной специфичностью (разными сайтами рестрикции). В результате сейчас известно более 350 рестриктаз разных бакте- [c.130]

Метод прерванной конъюгации удобен при физическом картировании генов, довольно удаленных друг от друга, но не может использоваться при картировании маркеров, находящихся на близком расстоянии. Такие локусы картируют посредством рекомбинационного анализа, основанного на тех же принципах, которые были использованы при постановке трехфакторных скреидиваний (гл. 5 и 7). [c.246]

В начале 80-х годов стало очевидно, что современкому генному инженеру компьютер необходим не менее (а иногда и более) чем физи ку, химику или экономисту. Возникла необходимость в создании автоматизированного рабочег о места генног о инженера. При этом выявилось, что ряд задач, возникающих у генных инженеров, связан с анализом огромного количества вариантов. Такие задачи не поддаются решению при помощи "лобовых подходов, для их анализа необходимо применение методов современной дискретной математики. Одна из та ких задач физическое (рестрикционное) картирование молекул ДНК -рассматривается в гл. 5 (Певзнер П.А.). Физическое картирование -один из самых распространенных методов анализа ДНК. В связи с предполагаемым ссквенированием генома человека объем работ по физическому картированию в ближайшие годы будет значительно увеличен. В настоящее время физическое картирование - один из разделов компьютерной генетики, где удалось "заставить" работать серьезные результаты из разных областей математики (теория графов, потоки в сетях, эргодическая теория). [c.7]

Проблемы, возникающие при построении физических карт. Казалось бы, описанный метод легко может быть использован для построения физических карт, однако его реализация наталкивается на несколько серьезных проблем (развитые программы физического картирования имеются только в двух современных пакетах программ по молекулярной генетике DNASIS и DNASTAR(Hoyle,1987)). [c.158]

Построение множественных физических карт. Уже в первых работах по физическому картированию было отмечено, что использование только информации о результатах двух одиночных и одной совместной рестрикции, как правило, не дает возможности однозначно восстановить физическую карту при числе сайтов около 10 ( по каждой рестриктазе) получаются десятки (а иногда сотни) карт, лежащих в пределах ошибок биохимического эксперимента ( Певзнер, Миронов,1987а). Причины этого кроются, с одной стороны, в недостаточно высокой точности определения размеров фрагментов, с другой - в огромном количестве вариантов взаимного расположения сайтов рестрикции. Для снятия неоднозначности приходится переходить от двух к нескольким рестриктазам ( известны случаи, когда использование даже 5 одиночных и 10 совместных рестрикций не давало возможности однозначно идентифицировать физическую карту). Таким образом, при переходе к нескольким рестриктазам вместо классической задачи построения парной физической карты (по двум SD- и одной DD- рестрикции) возникает задача построения множественной физической карты (по нескольким SD- и DD-рестрикциям), для решения которой предложен метод потенциалов (Певзнер,Миронов,1987а). В разделе 5.4 описывается метод потенциалов и обсуждаются трудности, возникающие при построения множественных физических карт. [c.159]

Голдстейн и Ватерман (Goldstein,Waterman,1987) показали, что даже в такой упрощенной постановке физическое картирование является NP-полной задачей (Гэри, Джонсон,1982). Таким образом, возможность построения эффективных(в смысле теории сложности Кука-Карпа) алгоритмов для физического картирования вызывает большие сомнения( известна гипотеза о том, что для NP-полных задач не существует полиномиального по сложности алгоритма решения) и основные усилия здесь следует сосредоточить на совершенствовании переборных схем. [c.178]

Оосуждавшиеся ранее проблемы отсутствия эффективных алгоритмов и относятся к задаче в то время как для задачи 2 в настоящее время известны эффективные алгоритмы решения, опирающиеся, на глубокие теоретико-графовые результаты. В этом параграфе обсуждается связь проблемы физического картирования с двумя задачами дискретной оптимизации - поиском максимального потока в сети и оптимального контура в графе, для решения которых известны эффективные комбинаторные ал- [c.178]

SPHJS THpoBaHHH больших геномов и построении подробных физичес-ких КМ.Т необходимо привлекать дополнительные методы. Мы рассмотрели методы физического картирования, основанные на анализе результатов одиночных и совместных рестрикций. При этом подходе экспериментальная работа сводится к минимуму, однако построение карты по такой косвенной информации вызывает большие математические трудности, которые не всегда удается преодолеть (при значительном числе сайтов рестрикции и ошибках в определении размеров фрагментов). Дополнительные биохимические эксперименты по картированию позволяют за счет дополнительной экспериментальной работы снять некоторые математические проблемы. Даже в тех случаях, когда математические проблемы удается преодолеть, при картировании больших геномов, как правило, возникает несколько физических карт, согласующихся с экспериментальной информацией - снять эту неоднозначность удается только при использовании дополнительных биохимических экспериментов. [c.186]

Установление точек действия различных рестриктаз позволяет проводить физическое картирование участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов). Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может быть использовано для его идентификации. Принцип рестрикционного картирования сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Молекулярную массу фрагментов обычно определяют, используя в качестве свидетеля ДНК известного размера. На электрофо-реграмме рестрикты-фрагменты ДНК различают, окрашивая их бромистым этидием и просматривая гель в ультрафиолетовом свете. Применяют также радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. [c.283]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Из результатов, представленных в таблице, становится ясным, что, используя простейший прием включения в реакционную смесь одного короткого праймера со случайной последовательностью, можно с помощью ПЦР амплифицировать конкретную (хотя заранее не определенную) часть генома с неизвестной первичной структурой. При этом сложность образующихся продуктов ПЦР можно контролировать с помощью длины олигонуклеотида, используемого в качестве праймера. Этот метод успешно используется для поиска информативных полиморфных маркеров, пригодных для физического картирования геномов животных и растений, а также идентификации организмов путем получения фингерпринтов их ДНК [315, 316 [c.238]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология