Нуклеаза, фрагменты, комплементарное взаимодействие

П.З. ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА И КОМПЛЕМЕНТАРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ [c.368]

Рис. 4-63. Многие виды рестрицирующих нуклеаз позволяют получать фрагменты ДНК с липкими (одноцепочечными) концами Фрагменты ДНК, обладающие такими концами, соединяются с помощью комплементарного взаимодействия пар оснований в области липких концов, как показано на схеме. Два фрагмента ДНК. объединяющиеся здесь, были получены с помощью рестрицирующей нуклеазы E o R1 (см. рис. 4-60).

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Другой тип экспериментов по модификации позволяет непосредственно обнаружить расплетенную область ДНК, входящую в состав бинарного открытого комплекса. При разделении цепей ДНК неспаренные аденины становятся чувствительными к дополнительному метилированию в присутствии ДМС. Если затем фрагмент ДНК освободить от фермента, расплетенная область ренатури-рует, за исключением метилированных остатков аденина, которые теперь содержат метильные группы в положении N 1, принимающем обычно участие в комплементарном взаимодействии оснований. Метильные группы мешают основаниям А узнавать своих партнеров Т. Это несовершенство в спаривании можно обнаружить при помощи фермента нуклеазы 81, которая специфически расщепляет ДНК в любом одноцепочечном участке. Как обычно, результаты такого расщепления анализируют электрофоре-тически, определяя размеры образующегося фрагмента, меченного по концу. [c.147]

Рис. 5-78. Липкие концы, образующиеся под действием многих рестрицирующих нуклеаз (см. рис. 4-63), обеспечивают возможность соединения двух фрагментов ДНК за счет комплементарных взаимодействий. Фрагменты ДНК, соединивщиеся таким путем, связываются затем ковалентно в высокоэффективной реакции, катализируемой ДНК-лигазой. Здесь представлен случай образования рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из

Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные хвосты . Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарном взаимодействию с любым другим конном, образовавшимся под действием того же фермента Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одн бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 10 идентичных молекул вирусной ДНК. а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором. [c.327]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология