Рестрицирующие нуклеазы

Рис. 4-63. Многие виды рестрицирующих нуклеаз позволяют получать фрагменты ДНК с липкими (одноцепочечными) концами Фрагменты ДНК, обладающие такими концами, соединяются с помощью комплементарного взаимодействия пар оснований в области липких концов, как показано на схеме. Два фрагмента ДНК. объединяющиеся здесь, были получены с помощью рестрицирующей нуклеазы E o R1 (см. рис. 4-60).

Рестрицирующие нуклеазы облегчают клонирование генов [55] [c.326]

Рестрицирующие нуклеазы расщепляют ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей 230 [c.511]

А. Не все рестрицирующие нуклеазы производят ступенчатые разрывы в ДНК. [c.41]

Индивидуальная рестрицирующая нуклеаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами (рестриктами). Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрицирующих нуклеаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других рестрикционных участков (рис. 4-61) Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет приближенно оценить гомологию между ними. Отсюда следует, что можно проводить сравнение различных участков ДНК (сравнивая их рестрикционные [c.230]

Рис. 4-61. Простой пример, иллюстрирующий взаимное расположение на двойной спирали ДНК участков узнавания для различных рестрицирующих нуклеаз (именуемых также сайтами рестрикции ), совокупность которых образует рестрикционную карту Заключение фермент А расщепляет вблизи одного из концов молекулы. Фермент Б должен расщеплять вблизи того же конца либо вблизи другого конца. Размеры фрагментов, образующихся при расщеплении 2 ферментами исключают первое предположение и позволяют установить порядок сайтов рестрикции, указанный ниже

Для защргты от молекул чужеродных ДНК, способных проникнуть в клетку и вызвать ее трансформацию, многие бактерии вырабатывают ферменты рестрицирующие иуклеазы, способные разрушить чужеродную ДНК. Каждый такой фермент опознает в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме самих бактерий замаскированы метилированием остатков А и С, но любая чужеродная молекула ДНК, попав в клетку, немедленно опознается нуклеазой, и обе цепи ее ДНК разрезаются (рис. 4-60). Из различных видов бактерий было выделено множество рестрицирующих нуклеаз. В настоящее время различными фирмами производтгтся более 100 таких ферментов, большинство из которых опознает различные последовательности нуклеотидов [c.230]

Многие рестрицирующие иуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами (рис. 4-63). Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы) (либо иной нуклеазы, которая создает такие же липкие концы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду или вирус, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента ДНК. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из к ДНК (комплементарной ДНК), т. е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК. Эти методы детально обсуждаются в гл. 5. [c.231]

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

Технология рекомбинантных ДНК произвела революцию в исследовании клетки. В настоящее время с помощью рестрицирующих нуклеаз можно вырезать любой участок клеточной ДНК и вставить его в самореплици- [c.246]

Рис. 5-78. Липкие концы, образующиеся под действием многих рестрицирующих нуклеаз (см. рис. 4-63), обеспечивают возможность соединения двух фрагментов ДНК за счет комплементарных взаимодействий. Фрагменты ДНК, соединивщиеся таким путем, связываются затем ковалентно в высокоэффективной реакции, катализируемой ДНК-лигазой. Здесь представлен случай образования рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из

Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные хвосты . Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарном взаимодействию с любым другим конном, образовавшимся под действием того же фермента Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одн бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 10 идентичных молекул вирусной ДНК. а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором. [c.327]

А. Правильно. (Например, рестрицирующая нуклеаза Smal разрезает [c.306]

Описанное выше в качестве одного из этапов клонирования разрезание генома на фрагменты с помощью рестрицирующей нуклеазы назьшают иногда методом дробовика (шотгая-клонирсжатш). Фрагменты ДНК образуются при этом в огромном количестве - до миллиона, если речь идет о геноме млекопитающих, а это жачит. что и число различных колоний трансфицированных клеток такзке должно достигать миллионов Каждая такая колония представляет собой клон, т. е. совокупность потомков одной к летки-родоначальницы, и рекомбинантная плазмида в любой клетке клона несет одну и ту же включенную в нее нуклеотидную последовательность геномной ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а вся совокупность плазмид вмещает библиотеку геномной ДНК. Однако, поскольку разрезание геномной ДНК на фрагменты определяется случаем, лишь некоторые образовавшиеся фрагменты содержат полноценные гены, во многие из них попадает только часть какого-нибудь гена, а в большинстве клонов геномной ДНК. полученных из ДНК высших эукариотических клеток. [c.328]

Рис. 5-90. Выявление псшиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) блот-анализомпо Саузерну, Дпя простоты в хромосомах показано лишь несколько сайтов рестрикции, хотя в действительности их многие тысячи. Если до воздействия рестрицирующей нуклеазой провести амплификацию соответствующего участка методом ПЦР, этот же тест можно провести без радиоизотопов и от блот-анализа отказаться.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология