Одноцепочечные хвосты

После этого образуется цепь (возможно, в форме отдельных фрагментов), комплементарная одноцепочечному хвосту . При полном обороте кольца получается цепь вирусной ДНК в два раза длиннее обычной. Процесс репликации завершается ее расщеплением при помощи соответствующей эндонуклеазы и сшиванием комплементарных нитей в кольцо лигазой. [c.278]

ДНК используют экзонуклеазную реакцию. После расщепления плазмиды рестриктазой в одной точке ее обрабатывают экзонуклеазой, разрушающей одну из цепей ДНК с ее свободного конца (3 или 5 ). Реакцию можно вести так, чтобы удалить желаемое число нуклеотидов ДНК. Затем нуклеазой S1 удаляют одноцепочечные хвосты и лигируют концы ДНК- [c.69]

Первый этап создания генно-инженерных организмов — выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты и разрезают их на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов — рестриктаз. Первые рестриктазы выделил в 1970 году Г.Смит (США). Оказалось, что разные рестриктазы способны производить разрывы молекулы ДНК в строго определенных последовательностях нуклеотидов (из 4 — 6 пар). Наибольшее значение имело выделение рестриктаз, которые дают фрагменты с так называемыми липкими (комплементарными) концами. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных наискось на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепочечные хвосты из нескольких нуклеотидов (табл. 2). [c.23]

Известно, что для инициации процесса репликации ДНК фага ФХ необходимо наличие в геноме фага специфического гена А. Недавно было показано, что этот ген детерминирует синтез белка с мол. весом 56 000 — специфической эндонуклеазы надрезающей вирусную цепь RF-формы, что необходимо для начала процесса репликации [209]. По-видимому, после появления такого разрыва стимулируется синтез небольшого участка РНК-затравки. Репликация ДНК протекает в большинстве случаев в двух направлениях (разд. Д,2), однако репликативная форма Ф X образуется, вероятно, только в одном направлении по механизму разматывающегося рулона (rolling ir le) [210]. В соответствии с этим механизмом [уравнение (15-9)], по мере того как вновь образующаяся цепь вирусной ДНК синтезируется вдоль комплементарной (минус) цепи-матрицы, исходная вирусная ДНК (плюс-цепь) вытеснется в виде одноцепочечного хвоста . [c.278]

Согласно другим данным, некоторые из повторяющихся последовательностей распределены по всему геному случайно. Об этом свидетельствует, например, тот факт, что при ренатурации фрагментов ДНК Дрозофилы образуются кольца ДНК, которые можно увидеть с помощью электронного микроскопа [278]. Кольца во время ренатурации могут образовываться в результате фрагментации внутри повторяющихся последовательностей. В хромосомах Хепориз может содержаться около -25% таких повторяющихся последовательностей. Данные, полученные при электронной микроскопии, свидетельствуют о том, что случайная реассоциация фрагментов ДНК приводит к образованию двухцепочечных участков, содержащих повторяющиеся нуклеотидные последовательности, с одноцепочечными хвостами . Последние обычно не спариваются, поскольку содержат уникальные последовательности, пришедшие из разных генов. У Хепори повторяющиеся фрагменты ДНК включают приблизительно 300 нуклеотидов, а неповторяющиеся, или уникальные, фрагменты, расположенные между ними, — приблизительно 800 нуклеотидов [275]. [c.298]

В настоящее время наиболее вероятной представляется такая последовательность событий, ведущих к включению вирус-специфической ДНК ретровирусов в клеточную хромосому (рис. 161). После образования кольцевой молекулы в месте стыка двух LTR возникает короткий несовершенный инвертированный повтор. Этот повтор выполняет функцию att, т. е. специфического участка интеграции. Участок att узнается вирус-специфическим с рментом, обладающим эндонуклеазной активностью — одним из продуктов гена poU который попадает в клетку из заражающей вирусной частицы. Фермент вносит в обе цепочки молекулы вирус-специфической ДНК разрывы на расстоянии 4 нуклеотидов друг от друга. Этот же фермент вносит ступенчатый разрыв (на расстоянии 4—6 нуклеотидов) и в клеточную ДНК- Положение разрыва в клеточной ДНК не фиксировано. Далее происходит интеграция вирусной ДНК в хозяйскую хромосому. Предполагают, что механизм интеграции напоминает тот, который реализуется в фаговых системах, прежде всего у фага Ми (см. раздел 1 этой главы), т. е. разрывы цепей ДНК и воссоединение гетерологичных нуклеотидных последовательностей осуществляет один и тот же фермент — особая топоизомераза (интеграза). Процессы типа репарационных (застраивание брешей и удаление одноцепочечных хвостов ) приводит к двум последствиям во- [c.312]

Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные хвосты . Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарном взаимодействию с любым другим конном, образовавшимся под действием того же фермента Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одн бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 10 идентичных молекул вирусной ДНК. а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором. [c.327]

Отметим, что у образовавшейся здесь двухцепочечной молекулы кДНК отсутствуют липкие концы такие молекулы ДНК, с тупыми концами, можно клонировать при помощи нескольких процедур, сходных с той, какая представлена на рис. 5-78, хотя и менее эффективно. Можно, например, пришить к концам к ДНК синтетические олигонуклеотиды, содержащие участки, в которых рестрицирующий фермент вызывает разрыв, или присоединить ферментативным путем к концам молекулы к ДНК одноцепочечные хвосты , чтобы облегчить включение этой молекулы в клонирующий вектор присутствует лишь некодирующая ДНК. составляющая, как известно, большую часть массы такого генома (см. разд. 9.1.3). [c.329]

Некоторые реакции, катализируемые эндонуклеазами, специфичными в отношении одноцепочечных участков. А. Отшепление одноцепочечных хвостов у дуплексной ДНК. Б. Разрезание дуплексной ДНК с локальзно расплетенным участком на два фрагмента. В. Разрезание дуплексной ДНК со шпильзкой на конце с образованием одного двухцепочечного дуплекса. Г. Разрезание дуплекса с пробелом с образованием двухцепочечных спиральных сегментов. Д. Разрезание дуплексной ДНК с одноцепочечной петлей в середине на двухцепочечные фрагменты. [c.213]

Эндонуклеазы, имеющие различные сайты узнавания и разрезания, часто образуют идентичные липкие концы. Например, под действием эндонуклеаз МЬо I, ВсП и Ват HI образуются 5 -концевые 5 -GAT -3 . В результате фрагменты, получающиеся при расщеплении данной ДНК любым из этих ферментов, при смещивании и отжиге будут соединяться друг с другом. Однако фрагменты, получающиеся из различных ДНК при разрезании эндонуклеазой Bgl I, вряд ли будут соединяться при отжиге, поскольку одноцепочечные хвосты могут содержать любую последовательность из трех нуклеотидов. [c.217]

ДНК) образование одноцепочечных хвостов и введение сайтов рестрикции. [c.289]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология