Пептиды, определение концевых групп

Трипсин и химотрипсин обладают наиболее высокой специфичностью по отношению к субстрату, что и используется для определения стерической однородности пептидов. Трипсин расщепляет только пептидные связи, в образовании которых принимают участие карбоксильные группы аргинина и лизина. Гидролиз протекает очень медленно или вообще не идет, если эта аминокислота является N-концевой или второй от N-конца пептида. Не расщепляются пептидные связи, образованные со-за-мещенными аминокислотами, и связи Lys-Pro и Arg-Pro. Неспецифический гидролиз происходит крайне редко (ср. [2678]). Химотрипсин расщепляет главным образом пептидные связи, в образовании которых принимает участие карбоксильная группа остатка ароматической аминокислоты. Иногда имеет место и неспецифический гидролиз, например по амидным связям лей-цил—аминокислота. На гидролиз, катализируемый химотрипсином, природа всей молекулы пептида оказывает большее влияние, чем на расщепление трипсином (ср. [2678]). [c.403]

Определение С-концевых остатков в пептидах и белках разработано менее удовлетворительно, нежели определение iV-концевых. Предлагались многочисленные химические методы, но ни один из них не выдержал проверку временем. К счастью, с помощью двух панкреатических ферментов — карбоксипептидазы А и карбокси-пептидазы-В — можно получить некоторую информацию о С-кон-цевой последовательности. Карбоксипептидаза А преимущественно отщепляет аминокислоты с ароматическими боковыми группами, а большинство остальных аминокислот отщепляет гораздо медленнее. С-концевой Pro устойчив. Этот фермент хорош при идентификации С-концевых последовательностей у пептидов, образующихся в результате расщепления с помощью а-химотрипсина (см. разд. 23.3.6), так как такие пептиды на С-конце имеют ароматические аминокислоты. При обработке пептида или белка карбокси-пептидазой А возникают те же трудности, что и при использовании аминопептидаз для анализа iV-концевых последовательностей (см. разд. 23.3.4.1). Карбоксипептидаза В гораздо более специфич- [c.272]

Электрофоретическое разделение НЬА и НЬ8 по методу подвижной границы показывает, что разница между зарядами этих молекул составляет один элементарный заряд на половину молекулы. Вполне возможно, что эта разница обусловлена заменой всего лишь одной аминокислоты в а- или р-цепи. Для того чтобы дать точный ответ, нужно было бы иметь данные полного анализа аминокислотной последовательности в обеих цепях. Однако установить участок, в котором два вида молекул гемоглобина различаются по аминокислотному составу, можно и без полного определения последовательности аминокислот. Протео-литический фермент трипсин гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы остатков лизина и аргинина. И лизин, и аргинин имеют сравнительно длинные неразветвленные боковые цепи с положительным зарядом на конце. В каждой половине молекулы гемоглобина на 287 аминокислотных остатков приходится около 26 остатков лизина и аргинина. Таким образом, трипсиновый гидролизат половины молекулы гемоглобина должен содержать около 28 пептидов (поскольку в каждой половине имеются две различные цепочки), каждый из которых содержит в среднем немногим больше 10 остатков. В действительности при таком гидролизе отщепляется устойчивое ядро , содержащее около четверти аминокислотного состава половины молекулы. Анализ состава этого ядра , отделенного центрифугированием от прочих пептидов, показывает, что в НЬА и в НЬЗ оно имеет одинаковый аминокислотный состав и, вероятно, одинаковую последовательность аминокислотных остатков. [c.223]

Определение концевых групп. Особое значение для выяснения строения пептидов имеет определение аминокислот, расположенных на концах полипептидной цепи. Если у какого-нибудь пептида или белка найдена одна единственная аминокислота в качестве Ы- или С-концевой группы, то с очень большой вероятностью можно считать его однородным соединением. [c.384]

Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота — свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно М-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор-2,4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с Ы-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения Н- и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [c.374]

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии. [c.54]

Предшественники (зимогены) — пепсиноген, трипсиноген и химо-трипсиноген получены в чистом виде. Активация заключается в удалении небольшого пептидного фрагмента и катализируется либо активной формой самого фермента, либо энтерокиназой, другим ферментом, имеющимся в пищеварительном тракте. При превращении трипсиноге-на в трипсин с N-конца белка отщепляются гексапептид вал— (асп)4 — лиз и N-концевой аминокислотой становится изолейцин (Нейрат , 1955). Активация других зимогенов более сложна. Ранние работы Бергмаина (1937) на простейших модельных пептидах показали, что ферменты избирательно расщепляют определенно пептидные связи. Пепсин, трипсин и химотрипсин известны как эндопептидазы, так как они расщепляют пептидные связи, расположенные внутри молекулы. Пепсин расщепляет амидные связи, образованные аминогруппами фенилаланина или тирозина химотрипсин расщепляет связи, образованные карбоксильными группами этих ароматических аминокислот. Трипсин расщепляет амидные связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот (лиз, арг). Эти протеолитические ферменты расщепляют также эфиры аналогичной структуры. Во всех случаях затрагиваются только пептиды, образованные -аминокислотами. Предположение Михаэлиса (1913), что реакции, катализируемые ферментами, проходят через стадию образования промежуточного фермент-субстратного комплекса, были подтверждены всеми последующими работами. С большой очевидностью показано, что каталитическая активность определяется небольшим участком фермента, так называемым его активным центром. [c.697]

Начальный этап в изучении первичной структуры пептида или белка состоит в определении N-концевой аминокислоты, т. е. той, которая находится на конце цепи и имеет свободную а-аминную группу. Ее можно при помощи специальных методов отщепить и точно идентифицировать. Затем то же самое можно повторить с концевой группой, оставшейся на конце цепи после отщепления первой. Повторяя операции несколько раз и осуществляя ступенчатый гидролиз цепи, возможно определить в нем аминокислотную последовательность с N-конца. Возможно подобное определение и аминокислоты со свободной а-СООН-группой (С-конце-вой), но при помощи иных методов. Этим способом можно определить лишь по несколько звеньев с обоих концов, так как повторные операции удается повторять не более чем 5— 12 раз. Однако таким путем не трудно расшифровывать строение пептидов — продуктов гидролиза белка. [c.24]

В случае применения безводных органических растворителей, содержащих кислоту, возможна миграция ацильных групп, находящихся у определенных остатков оксиаминокислот. Так, при определении концевых групп по методу Эдмана (см. стр. 237—245), согласно которому производное пептида обрабатывают нитрометаном и НС1 [87], уксусной кислотой й НС1 [88] или диоксаном и НС1 [186] для циклизации Ы-Конце-вого остатка, установлено [2, 314], что на последующих стадиях отщепления обнаруживаются небольшие Количества Ы-концевь1Х остатков серина или треонина. В одном случае это привело к неправильному выводу о последовательности аминокислотных остатков [2, 186]. Обычно исследуемое соединение обрабатывают СвНаЫСЗ или динитрофторбензолом при pH 8,5. Если же белок находится в среде с такой величиной pH до добавления реагента, то свободные аминогруппы, появляющиеся в результате миграции ацильной группы от N к О, вновь образуют пептидные связи. Предварительную [c.222]

Наличие этаиоламина на карбоксильном конце выделенного пептида гарантирует принадлежность этого пептида карбоксильному концу белка. Возможные невысокие выходы присоединения этаиоламина к белку не являются серьезным ограничением метода, так как любой неамидированный пептид после ЭФ оказывается смещенным с диагонали и поэтому не мешает определению искомого фрагмента. Наконец, метод должен оказаться применимым к белкам, имеющим природную амидироваиную С-концевую аминокислоту, так как подобные белки содержат блокирующую группу того же типа, что и при искусственном амидировании. [c.487]

В этом уравнении указана только концевая часть пептидной цепи. Карбоксипепти-даза атакует только амидную группу иа конце цепи. Однако ее активность не зависит от природы боковых цепей К и К. Карбоксипептидазы катализируют гидролиз пептидов, но не обладают никакой активностью в гидролизе жиров последнюю реакцию катализирует совершенно другая группа ферментов. Присущая ферментам высокая степень специфичности необходима для того, чтобы все реакции, протекающие в сложных организмах, были в определенной мере независимы друг от друга. [c.451]

При планировании синтеза пептидов значительного размера нужно уделить особое внимание как разработке общего или стратегического плана, так и тактике, с помощью которой этот план может быть эффективно выполнен [110]. Основной стратегический замысел состоит в способе, которым может быть достигнуто построение определенной последовательности остатков аминокислот, т. е. либо ступенчатым способом по одному остатку за одну ступень, начиная с концевой амино- или карбоксигруппы, либо путем объединения нескольких частей с определенной последовательностью (конденсация фрагментов), проводя синтез либо в растворе, либо твердофазным способом и т. д. Тактические соображения включают выбор подходящего сочетания защитных групп для концевых амино- и карбоксильных групп для различных боковых радикалов аминокислот. Некоторые из этих защитных групп постоянны , т. е. сохраняются до конца синтеза, другие — временны , т. е. подлежат отщеплению на промежуточных стадиях синтеза, что дает возможность создания определенного типа пептидной связи или это производится для того, чтобы нужным образом изменить растворимость и т. д. Условия для снятия защитных групп должны быть выбраны с учетом аминокислотного состава пептида. Другую часть тактики составляет выбор методики создат ния пептидной связи, выбор растворителя, особенно в связи с опас ностью рацемизации. [c.408]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Благодаря работе Санжера были достигнуты большие успехи в установлении структуры ряда других гормонов, в частности адренокортикотропных гормонов (АКТГ) из передней доли гипофиза [100, 102]. Было установлено, что АКТГ имеют 39 аминокислотных остатков в нолипентидной цепи. Для установления последовательности аминокислот двумя группами исследователей были использованы различные протеолитические ферменты в сочетании с частичным кислотным гидролизом или без него. В первом случае после переваривания трипсином и химотрипсином были получены пептидные фрагменты, разделение которых достигалось с помощью электрофореза, противоточного распределения, ионообменной и бумажной хроматографии. Затем проводили определение последовательности аминокислот с помощью фенилизотиоциа-ната и метода динитрофенилирования для К-концевых аминокислот соответствующих пептидов, а также гидролиз карбоксипептидазой аминокислот с С-конца гормона. Таким образом была определена последовательность аминокислот для бычьего кортикотро-пина VI [103] [c.412]

Ограничения. метода 1) неполное присоединение С-конце-вой ампиокпслоты к бензильным группам полимера может приводить к образованию примесей, например при синтезе пента-пептида А —А —А —А —А может быть образована цепь А2—.-V—А —А при реакции второй аминокислоты с оставшейся в первой стадии бензнльной группой. Эта реакция конкурирует со стадией Б 2) неполное присоединение Х-защищенной ампиокпслоты к свободной аминогруппе (стадия Б) может привести к образованию сокращенных пептидов (например. А — А —и неправильной последовательности (например, А — А2—А —А ) 3) отсутствие аналитических методов определения примесей, которые могут применяться без отделения пептида от полимера. Такое определение может быть очень расточительным, требовать много времени и само по себе приводит к распаду продукта. [c.333]

Гидролазы. К этому классу относятся протеолитические ферменты, расщепляющие пептидные связи в белках и пептидах пепсин желудочного сока, трипсин и химотрипсин, получаемые из поджелудочной железы, аминопептидаза кищечника, папаин из сока дынного дерева и др. Специфичность действия этих ферментов зависит от их способности разрывать лищь те пептидные связи, которые находятся в определенном для каждого фермента окружении . Так, некоторые ферменты разрушают только концевые связи в белках (экзопептидазы), другие (эндопептидазы) действуют на пептидные связи, лежащие далеко от концов молекулы. Кроме того, имеет значение наличие вблизи от разрываемых связей полярных групп аминных, сульфгидрильных или оксигрупп. Протеолитические ферменты действуют только на -формы белков и совсем не действуют на Д-формы. [c.59]

Для ферментативного определения Ы-концевых групп иногда применяют и аминопептидазы — ферменты, которые последовательно отщепляют аминокислоты с Ы-конца полипептидной цепи. Наиболее хорошо изученным и часто применяемым ферментом является лейцинаминопептидаза, выделяемая из почек свиньи. Этот энзим был использован для изучения Ы-концевой последовательности инсулина и рибонуклеазы. В опытах на синтетических пептидах и амидах аминокислот было показано, что весьма медленно отщепляются те Ы-концевые аминокислоты, рядом с которыми стоят лизин, аргинин И ароматические аминокислоты. Эта относительно узкая специфичность действия энзима затрудняет его применение специфичность действия других аминопеп-тидаз изучена недостаточно. [c.75]

Изучение последовательности аминокислотных остатков в рибонуклеазе практически началось с работ К. Анфинсена и его сотрудников, которые в 1954 г. при помощи метода динитрофенилирования установили, что ее молекула представляет собой одиночную пептидную цепь, на М-конце которой имеется следующая последовательность аминокислотных остатков лиз.глу.-тре.ала. [1]. Немного позже к изучению химической природы рибонуклеазы приступила группа исследователей Рокфеллеровского института в США, во главе которой стояли Мур, Стейн и Хирс. Группа этих ученых провела определение химического состава рибонуклеазы и установила, что составляющая ее полипептидная цепь содержит 124—126 аминокислотных остатков, которые были определены количественно [413]. Следующим этапом изучения химического строения рибонуклеазы явилось окисление ее надмуравьиной кислотой при низкой температуре, что исключало возможность модификации тирозина. При этом происходил разрыв дисульфидных связей с образованием восьми сульфоновых групп и переход четырех остатков метионина в соответствующее сульфоновое производное. После гидролиза трипсином изучали тринадцать наиболее крупных пептидов, содержавших все 124 аминокислотных остатка, входивших в состав рибонуклеазы [255]. Для выяснения порядка соединения этих пептидов друг с другом было проведено параллельное исследование пептидов пептического и химотриптического гидролизатов, что позволило построить неполную формулу окисленной рибонуклеазы, которая была дополнена сведениями о расположении амидных групп глютаминовой и аспарагиновой кислот [39]. [c.136]

Формольное титрование. Формольное титрование является способом определения амино- и иминогрупп в аминокислотах и пептидах, основанным на большом сдвиге кажущейся константы диссоциации основных групп при их соединении с формальдегидом. Эта реакция интенсивно изучалась Гаррисом, Леви и др. [533, 541, 542, 543—546, 547—550]. Для большей точности рекомендовано применение стеклянного электрода. Датгн с сотрудниками [551, 552] показали, что для чистых аминокислот достижима точность +0,1%. Все растворы должны быть возможно более крепкими до прибавле п1я формальдегида должен быть pH 6, а конечная точка должна бьт. около pH 9. Концентрация формальдегида в конце титро- [c.106]

Реакция фенилизотиоцианата с аминогруппами белков очень похожа на соответствующую реакцию изоцианатов. Было найдено, что фенил-изотиоцианат можно применять для определения содержания аминных концевых групп в белках и последовательности аминокислот в полипептидах и белках в последнем случае проводят постадийное расщепление с аминного конца молекулы. Метод основан на специфической реакционной способности фенилизотиоцианата, который в среде пиридина реагирует с концевыми аминогруппами, образуя фенилтиокарбамилпептиды (ФТК-пептиды). Эти производные при нагревании с безводным хлористым водородом в среде нитрометана легко перегруппировываются, образуя фенил-тиогидантоин N-концевого аминокислотного остатка исходного белка. При нагревании со щелочью фенилтиогидантоин расщепляется, образуя свободную аминокислоту, которую можно идентифицировать, например. [c.370]

Хотя из литературных данных известно, что изучались различные химические методы определения С-концевых аминокислот [206], ни один из этих методов не обнаружил достаточно удовлетворительных результатов, которые давали бы основание к его широкому использованию. Поэтому наибольшее распространение получил способ, основанный не на химической, а на ферментативной реакции с карбоксипептидазой — ферментом, реагирующим лишь с теми пептидами, которые содержат свободную карбоксильную группу. Поскольку рассмотрение ферментативных реакций выходит за рамки настоящего раздела книги, реакция с карбоксипептидазой в данном изложении не описывается. Следует отметить, однако, что проблема развития химии белка настолько важна, что вполне оправданы постоянно продолжающиеся исследования, направленные на поиск и разработку удобных и с широкими возможностями применения химических методов. Было показано, что для установления последовательности аминокислот с С-конца белковой молекулы по крайней мере ограниченное применение могут найти три разных химических метода, так как они дают результаты, подтверждающие данные, получающиеся при использовании карбоксипептидазы. Речь идет о гидразинолизе, этерификации с последующим восстановлением сложноэфирной группы на конце молекулы в спиртовую, а также о реакции с неорганическим тиоци-анатом. [c.376]

В ряде случаев возвращение к физиологическим условиям позволяет полипептиду снова вернуться к нативной конформации, особенно если она стабилизирована внутрицеп-ными 5—8-связями. Однако такая ренатурация возможна только для одноцепочечных пептидов. Например, молекула инсулина, состоящая из двух пептидных цепей, связанных 8— -мостиками, после разрушения этих мостиков и денатурации не может вернуться к нативной конформации. Это определяется особенностями синтеза инсулина. Нативная конформация инсулина возникает в результате гидролиза проинсулина. Как показано на рис. 5, проинсулин синтезируется как одна пептидная цепь, содержащая на концах два участка А- и В-цепи будущего инсулина с шестью свободными цистеиновыми группами в их составе. Средний участок проинсулина (С см. рис. 5) принимает такую конформацию, при которой устанавливается определенная система 8—8-связей между концевыми участками цепи. После выщепления среднего участка возникает активная двухцепочечная молекула инсулина. Именно по причине пространственной предопределенности этой структуры за счет среднего участка проинсулина спонтанная ренатурация инсулина невозможна. Иными словами, удаление части пептидной цепи равнозначно потере молекулярной информации для оставшихся частей инсулина. [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология