Электрофокусирование время

В настоящее время отсутствуют прямые доказательства влияния амфолитов-носителей на р1. Тот факт, что величина р1 не зависит от концентрации амфолитов-носителей [24] и в некоторых случаях от присутствия 6 М мочевины [28], свидетельствует о том, что амфолиты не образуют комплексов с белками. Электростатическое взаимодействие между белком и амфолитами с одинаковыми изоточками должно быть минимальным при плавном электрофокусировании, когда оба компонента имеют нулевой суммарный заряд. Таким образом, любое обратимое взаимодействие белка и амфолита при значениях pH, далеких от их изоточек, не должно сказываться на результатах фракционирования. Однако нельзя совсем исключить возможность комплексообразования. [c.320]

Закрывают нижний конец трубки и заполняют ее указанным выше раствором, не доходя 5 мм до края. Сверху тонко оттянутой пипеткой наносят слой воды толщиной 3 мм. При химической полимеризации гель застывает через 20—30 мин после приготовления рабочего раствора (20—25°С). Для фотополимеризации необходима экспозиция при сильном освещении в течение 30 мин. В том и в другом случае скорость полимеризации можно снизить, охлаждая рабочий раствор. Перед заполнением трубок рабочий раствор нужно дегазировать, для этого его выдерживают в вакууме при осторожном встряхивании. Эта мера позволяет избежать появления пузырьков в геле во время электрофокусирования. [c.325]

Вестерберг и Свеиссон [24] сравнивали поведение компонентов миоглобина во время электрофокусирования при 4 и 25°С. Они обнаружили, что pH сфокусированной зоны не зависит от температуры эксперимента и определяется лишь температурой, при которой производили измерение. Следовательно, для определения изоточки при данной температуре можно измерить pH в соответствующих условиях независимо от температуры фокусирования. Обычно р1 уменьшается при увеличении температуры. [c.308]

Гис. 5. Электрофокусирование гемоглобина человека в градиенте плотности на колонке Вестерберга и Свенссона (время опыта 65 ч) [1]. [c.315]

На рис. 8 приведена схема прибора для диск-электрофо-реза, подготовленного для электрофокусирования в геле. Находящийся в трубках полиакриламидный гель содержит амфолиты-носители, которые вместе с образцом равномерно распределены по всему гелю или наслоены сверху. Для предотвращения окисления или восстановления амфолитов-носителей (на аноде и катоде соответственно) электроды погружают в раствор кислоты или основания. Во время электролиза кислота благодаря отрицательному заряду сульфат-иона остается в анодном отделении. В кислой среде над слоем геля амфолиты-носители приобретают положительный заряд и вследствие этого стремятся к кётоду. При подаче постоянного напряжения амфолиты распределяются по трубке в порядке их изоточек и фокусируют ам-фолиТы-Образцы в областях, соответствующих их изоточкам. Напротив, в основной среде вблизи катода амфолиты заряжены отрицательно и вследствие этого движутся к аноду. После удаления из трубок гель можно анализировать любыми методами, позволяющими избежать влияния амфолитов-носителей. [c.321]

Электрофокусирование образца, нанесенного в виде узкой зоны, осуществляется быстрее по сравнению с образцом, распределенным по всему, гелю (для овадьбумина й гемоглобина это время составляет 20 мин и около 45 мин соЬт йтствёнйо). [c.330]

При ИЭФ особенно целесообразно пользоваться источниками тока постоянной мощности, так как сопротивление геля по мере утраты зарядов амфолитами непрерывно увеличивается. Напряжение, подаваемое на гель толщиной 2 мм в приборе Мультифор, может возрастать в ходе ИЭФ от начального значения 300—500 В в зависимости от выбранного интервала pH амфолитов до 1000 и даже 1500 В, в то время как сила тока падает от 80 до 20—25 мА. Эти ориентировочные цифры приведены для случая фокусирования в поперечном направлении. Плотность тока определяется напряженностью электрического поля, которая в ходе ИЭФ может изменяться от 20—50 до 100— 150 В/см. Это намного больше, чем обычная напряженность поля при электрофорезе. Такая разница обусловлена заметно меньшей плотностью тока при электрофокусировании по сравнению с электрофорезом. При фокусировании белков в продольном направлении при таких же значениях напряженности поля и плотности тока общее напряжение, подаваемое от источника, должно быть больше, а суммарная сила тока — меньше в соответствии с увеличением длины и уменьшением сечения пластины геля. [c.32]

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ (от англ. dot — пятнышко) — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. [c.57]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология