Двумерный электрофорез

Двумерный электрофорез. Данный метод более трудоемкий, требует двух последовательных электрофорезов. [c.40]

Специфичность, чувствительность и разрешающую способность хроматографического метода можно увеличить, если использовать двумерную хроматографию в сочетании с таким методом, как электрофорез, где разделение осуществляется в градиенте сильного электрического поля. Например, применяя двумерный электрофорез, можно разделить 2000 белков крови в одном эксперименте. Для этого сначала пятно, содержащее смесь этих белков, подвергают в определенных условиях обычному разделению по одному направлению. При [c.194]

С помощью двумерного электрофореза предложено определять пептиды, содержащие 8—З-связи [14]. Ферментативный гидроли- [c.237]

После того как установлена первичная структура- какого-либо белка, обычно нет необходимости проводить полное изучение аминокислотной последовательности у гомологичных белков из близких (соответствующих) источников. Быстрый ответ можно получить, используя технику трипсинового фингерпринта . Для этого подвергают гидролизу трипсином белок с известной структурой и параллельно ему гомологичный белок полученные в результате гидролиза пептиды разделяют обычно с помощью двумерного электрофореза или хроматографии. Если разница в последовательностях невелика, то больщинство пептидов должны занимать идентичное положение на двумерном фингерпринте. Те немногие пептиды, которые отличаются по подвижности, необходимо элюи-.ровать и подвергнуть аминокислотному анализу по Эдману. Эта техника особенно полезна при изучении аномальных гемоглобинов, которые отличаются от нормального природой только одного участка. [c.276]

С помощью БХ можно разделить и анализировать практически все классы хим. соед., в т. ч аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, БХ в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных в-в, в частности пептидов. [c.325]

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Ввиду того что установление последовательности аминокислот белков представляет трудоемкую и сложную задачу, усилия были направлены на совершенствование современной методики и технических средств. Речь идет о методе выявления термочувствительных аллелей, который позволяет обнаруживать в среднем вдвое большую изменчивость [89]. Это относится также к методу двумерного электрофореза. [c.61]

С точки зрения биохимии белки клетки и в более широком аспекте белки листьев представляют целое собрание самых разнообразных молекул. Проведенными недавно подсчетами с помош,ью двумерного электрофореза после экстракции в диссоциирующей среде (мочевина — детергент) обнаружено более 300 основных белков в листьях табака [38] и 250 — в листьях шелковицы [45]. [c.236]

Считается, что ДНК пластид может кодировать приблизительно 180 полипептидов со средней молекулярной массой 20 000 Да [111]. Так, двумерным электрофорезом выявляется 150 основ- [c.237]

Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5—6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3—0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двумерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта — простота исполнения, вертикального — большая разрешающая сила. [c.147]

Разделение сложных смесей на бумаге методами хроматографии или электрофореза в одном направлении не всегда приводит к получению чистых веществ. Очевидно, что для увеличения рабочего поля, на котором распределяются вещества, хроматографию или электрофорез (или их комбинацию) выгоднее проводить в двух взаимно перпендикулярных направлениях. При проведении такого двумерного разделения в одинаковых условиях по обоим направлениям все компоненты распределяются по диагонали рабочего поля. Для использования всего имеющегося поля условия разделения во взаимно перпендикулярных направлениях должны отличаться. Поэтому двумерный электрофорез проводят при различных pH, а двумерную хроматографию — в различных буферных системах. Комбинированный способ разделения веществ, когда в одном направлении проводится электрофорез, а в перпендикулярном ему — хроматография, по своему значению стоит на первом месте. Менее гибок метод двумерной хроматографии, еще меньшее значение имеет двумерный электрофорез. [c.234]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

Сложные смеси аминокислот или пептидов можно разделять либо с помощью двумерного электрофореза на квадратных листах бумаги, либо проводя одномерный электрофорез в одном направлении, а хроматографию в перпендикулярном направлении (рис. 5.1). [c.134]

При двумерном разделении белков и пептидов возможны различные комбинации методов электрофорез с градиентным гелем и изоэлектрической фокусировкой [212], гель-фильтрация с изоэлектрической фокусировкой [213], гель-фильтрация с электрофорезом [214], двумерный электрофорез с различными буферными системами [215—218], двумерная хроматография с различными растворителями [219—221] и хроматография в сочетании с электрофорезом или изоэлектрической фокусировкой. Райт и др. [222] оценивали результаты одно- и двумерного разделения сложных смесей белков, подсчитывая число разделенных полос, и установили, что двумерный электрофорез на геле акриламида дает большее число полос, чем периодический или непрерывный градиентный электрофорез на геле акриламида, изоэлектрическая фокусировка или изоэлектрическая фокусировка, сопровождаемая непрерывным градиентным электрофорезом на геле. [c.518]

Анализ субъединиц глютенина с помощью электрофореза при кислых pH или двумерного электрофореза ДДС-ПААГ-ИЭФ или ДДС-ПААГ в формирующемся градиенте pH обнаруживает значительные различия их зарядов. Каждую полосу, наблюдаемую при одномерном электрофорезе и соответствующую определенной молекулярной массе, можно посредством электрофокусирования разделить на большое число белков, отличающихся своими изоэлектрическими точками. Так, по Данно и др. [57], субъединицы с предполагаемой молекулярной массой в пределах [c.208]

Первую информацию о составе пептидной смеси и характере полученных фрагментов (без выделения пептидов в чистом виде) даст использование двумерного фракционирования на бумаге сочетание высоковольтного электрофореза в одном направлении и хроматографии в другом направлении, двумерная бумажная хроматография, двумерный электрофорез и др. На рис. 14 приведен пример такого разделения смеси пептидных фрагментов, образовавшихся при гидролизе трипсином лизоцима белка яиц. В качестве стандартов с / = 1 были использованы феноловый красный и аргинин. [c.83]

М мочевины, 1 мМ ДТТ и 0,5% метиламина. На колонке СМ-целлюлозы (1 X 30 см) линейным градиентом концентрации Na l (О—0,4 М) смесь белков удавалось разделить примерно на 20 фракций (рис. 122). Конечно, по своему качеству это разделение уступает двумерному электрофорезу рибосомальных белков, но зато его можно вести в любом препаративном масштабе и нет проблемы элюции белков из геля. [c.311]

Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных цепочек, в то время как эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи. Одни из них гидролизуют лишь одноцепочечные молекулы, другие— двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда как другие надрезают молекулу, внося разрыв лишь в одну из цепей. Специфичность ряда нуклеаз отражена в табл. 2-11. Частичный ферментативный гидролиз РНК дает расщепление молекулы на короткие нуклеотидные последовательности, позволяющие далее определить полную последовательность РНК. (Первой РНК, для которой установлена последовательность, была аланиновая тРНК. Расщепление проводили с помощью панкреатической рибонуклеазы и рибонуклеазы Т1 [133]. Очень полезным методом получения нуклеотидных карт оказался двумерный электрофорез в полиакриламидном геле [134]. [c.168]

После очистки субъединиц с молекулярной массой 44 ООО Да были обнаружены последовательности трех типов а-последова-тельность, 7-последовательность, произошедшая от агрегированных глиадинов с низкой молекулярной массой, и специфическая последовательность, очень сходная с той, которую можно предполагать по результатам исследований Хюбнера и Уолла [100] (табл. 6Б.15). Было подтверждено также, что агрегированные глиадины состоят из специфических субъединиц, отличающихся от других глиадинов, как это следует из анализа методом двумерного электрофореза [101]. [c.210]

Раств-сть ди-НС1 р. HjO. Связь —S—S— может бьггь расщеплена 10 мМ меркаптоэтанолом использ. при определении поперечно-сшитых компонентов при двумерном электрофорезе в ДСН-геле. Родственные реагенты имеют соединительную группировку, содержащую гликоль, который может расщепляться перйодатом (см. литературу в начале раздела). [c.320]

Б. Камера Канкеля — Тизелиуса [18]. В этом приборе полоски бумаги для электрофореза помещаются между двумя силикониро-ванными пластмассовыми пластинами, которые устраняют нежелательное испарение буферного раствора, что препятствует изменению его концентрации. Кроме того, этот прибор пригоден и для двумерного электрофореза (фиг. 3). [c.49]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Рис. 4-52. Фракционирование белков клетки Е. oli методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белки разделяли соответственно их изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического фокусирования слева направо Затем в присутствии ДСН их разделяли методом электрофореза сверху вниз в соответствии с молекулярной массой их субъединиц

Можно представить себе, что обычный регуляторный ген , активированный соответствующим сигналом дифференциации, инициирует биосинтез всех компонентов клетки, характерных для соответствующей стадии дифференциации. Но это не так. Напрнмер, стадии, необходимые для морфологической дифференциации, регулируются независимо от стадий, необходимых для синтеза медиатора. Эта область исследования бурно развивается п мы должны удовлетвориться кратким описанием, чтобы не утонуть в потоке предварительных наблюдений. Один из методов исследования заключается в действии на подходящую клеточную линию биологических (например, фактор роста нерва, сокращенно NGF рис. 11.3) или искусственных (например, ди-бутирил-сАМР, диметилсульфоксид) стимулов до тех пор, пока нейриты разрастутся параллельно устанавливаются, например, изменения состава ферментов или мембранных белков. Интересно отметить, что в ходе дифференциации in vitro наблюдались только количественные изменения в составе белка таких клеточных линий хотя используемый для анализа метод двумерного электрофореза очень чувствителен, ни один новый белок не был идентифицирован и ни один из ранее присутствовавших белков не псчез. [c.323]

Сколько генов содержится в одной хромосоме На этот вопрос мы можем дать приблизительный ответ в случае Е. oli. Предполагают, что в единственной хромосоме Е. соИ содержится более 3000 генов, возможно даже 5000. Была сделана попытка непосредственно подсчитать все полипептиды, присутствующие в Е. соИ после разделения их методом двумерного электрофореза. На электрофореграм-мах было обнаружено около 1100 пятен, соответствующих отдельным полипептидным цепям (рис. 27-25). Однако это число является минимальным, подкольку данный метод не позволяет разделить все полипептиды и не обладает достаточной чувствительностью, чтобы уловить присутствие белков, представленных в клетке всего лишь несколькими молекулами. [c.877]

Электрофорез на крахмальном геле использовали также для разделения и идентификации гемоглобинов [195—197]. Раймонд и сотр. [198—200] считают целесообразным проводить электрофорез на геле акриламида. Как и на крахмальном геле, при этом на акрпламиде можно добиться лучшего разделения, чем на агаровом студне. Эти авторы исследовали разделение проб сыворотки на 3—25 %-ных гелях. Эти же авторы описали методику двумерного электрофореза. Согласно этой методике, электрофорез проводят в одном направлении при данной концентрации геля, затем полосу геля, содержащую разделенные белки, внедряют в слой геля другой концентрации и повторяют электрофорез в другом направлении. Эспиноза [201] использовал такой же принцип и проводил в одном направлении разделение на агаровом геле, а в другом — на крахмальном геле. [c.517]

Осадок растворяют в 50 мкл буфера Б и прибавляют 50 мкл раствора панкреатической РНК-азы в буфере Б (1 единицу фермента на каждые 20 мкг Р-РНК). Реакционную смесь инкубируют 4 ч при 40 С. Для адсорбции нуклеазы прибавляют бентонит (примерно 2 мкг бентонита на каждую единицу фермента). Смесь охлаждают несколько часов и центрифугируют при 17 OOOg в течение 30 мин для осаждения комплекса бентонит-нуклеаза. Надосадочную жидкость отделяют микропипеткой, смешивают с двумя объемами концентрированного NH4OH, выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч и затем лиофилизуют. Остаток растворяют в 5-20 мкл воды для проведения двумерного электрофореза. [c.297]

Рис. 10.11. Двумерный электрофорез на бумаге продуктов расщепления ри-бонуклеазой Ti инициаторной тРНК из Drosophila (А) и из печени форели (Б) (Р. Дж. Данн и Г. Дж. Каулинг. неопубликованные результаты).

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Контроль за белковым составом эндосперма зерновых культур проводится различными методами. Например, с помощью двумерного электрофореза белков эндосперма одного из сортов мягкой пщеницы было обнаружено 60 основных компонентов и вдвое больше минорных. Состав белков у пшеницы осложняется тем, что она содержит три различных генома, причем запасные белки каждого генома различаются. Спектры белков одного из сортов диплоидного ячменя проще, хотя на фореграмме обнаруживается по меньшей мере 40 компонентов. Исследователи наблюдали, что сходной степенью сложности обладают спектры белков эндоспер ма кукурузы. [c.384]

На основании результатов, полученных с помощью двумерного электрофореза на крахмальном геле, Смитис и Коннел [89] предположили, что транс-феррины отличаются друг от друга скорее по величине заряда, чем по размерам молекул. Опыты по удалению сиаловой кислоты из трансферрина с помощью нейраминидазы показали, что различие в подвижности между самым быстрым вариантом Вьае и самым медленным Вд можно представить как разницу в четыре единицы заряда. Поэтому вполне вероятно, что каждый [c.130]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология