ДНК-фосфатаза-экзонуклеаза

Фиг. 41. Последовательные этапы действия экзонуклеазы III Е. oli (ДНК-фосфатаза-экзонуклеаза) на цепь ДНК, концевой нуклеотид которой несет З -фосфатную группу [45].

ДНК-полимераза, или дупликаза, иными словами — ДНК-нуклеотидилтрансфераза (К. Ф., 2.7.7.7.), получена теперь в виде чрезвычайно чистого препарата [28, 97] из экстрактов Е. olt. Этот препарат однороден и не разделяется нри седиментации, хроматографии и электрофорезе на крахмальном геле. Очищенные препараты содержат нуклеазы, и только на последних этапах очистки от полимеразы удается отделить так называемую экзонуклеазу III (ДНК-фосфатаза-экзонуклеазу, стр. 95). Даже наиболее чистые препараты еще содержат некоторое количество экзонуклеазы II (стр. 94), причем соотношение между активно- [c.199]

Ферменты. В указанных выще методах применяются следующие ферменты эвдонуклеазы или рестриктазы обратная транскриптаза или ревертаза ДНК-лигазы экзонуклеазы щелочная фосфатаза полинуклеотидкиназа концевая дезаксинуклеотидилтрансфераза ДНК-полимераза. [c.499]

Этот фермент найден в небо,льших количествах, причем он тесно связан с ДНК-нолимеразой Е. oli. Разделение этих двух ферментов производится при помощи хроматографии на бумаге. Экзонуклеазное действие этого фермента весьма сходно с действием экзонуклеазы II из Е. oli. Однако, помимо этого, экзонуклеаза III проявляет активность фосфатазы, высокоспецифичной для фосфатных остатков, этерифицированных по концевым 3 -гидроксильным группам цепи ДНК (фиг. 41). Экзонуклеаза III [c.95]

Экзонуклеаза III —ДНК-специфическая фосфатаза. В небольших количествах обнаружена в клетках кишечной палочки и, как правило, ассоциирована с ДНК-полимеразой. Действие этого фермента весьма напоминает действие экзонуклеазы II, но экзонуклеаза III к тому же характеризуется высокоспецифичной фосфатазнойак- [c.88]

Как видно из этой схемы, концевой нуклеозид можно идентифицировать только в случае отсутствия на концах олиго-или полинуклеотида фосфатных групп. При наличии фосфори-лированных концов фермент будет неактивен, или же концевой нуклеозид окажется фосфорилированным и, следовательно, неотличимь1м от других образующихся нуклеотидов. Обработка полинуклеотида фосфомоноэстеразой, не содержащей примесей нуклеаз (например, высокоочищенной щелочной фосфатазой Е, oli А-19), приводит к полимеру, не этерифицированному по концевым нуклеозидам и, таким образом, чувствительному к действию любой из экзонуклеаз. [c.46]

Удобный, но отнюдь не количественный метод определе,-ния активности лигазы состоит в том, что замыкаются кольца небольшие кольцевые молекулы ДНК, расщепленные такой рестриктирующей эндонуклеазой, которая приводит к образованию липких концов и которая свободна от примеси фосфатазы и экзонуклеазы. Более традиционные методы тестирования активности описаны в приведенных ниже работах (Weiss et al., 1968 Modri h and Lehman, 1970). По-видимому, с помощью большинства методов нельзя правильно определить активность лигазы до jex пор, пока препарат не будет первый раз очищен на DE-52. После очистку на Р-11 активность препарата можно правильно определить уже любым способом. [c.140]

Следует отметить описанную возможность ферментативного удаления неиспользованного количества праймеров после завершения первой стадии ПЦР с помощью экзонуклеазы VII [Li et al,, 1991], Экзонуклеаза VII проявляет свою активность по отношению к одноцепочечным фрагментам ДНК, начиная одновременный гидролиз как с 5 -, так и с З -концов, не оказывая при этом заметного действия на двуцепочечные продукты амплификации. Был предложен и другой подход, требующий, как и при осаждении фрагментов ДНК, только одну пробирку и заключающийся в ферментативном разрушении с помощью экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы краба неиспользованных дНТФ и праймеров [Werle et al,, 1994]. Метод относительно прост и исключает потерю ДНК во время многочисленных процедур, применяемых при очистке ПЦР-продуктов более сложными методами, описанными ниже. [c.143]

Кроме рассмотренных выше, в экспериментах по клонированию фрагментов ДНК и анализу структуры гибридных ДНК используют большой набор других ферментов нуклеинового обмена. К ним относятся полинуклеотидки-наза, щелочная фосфатаза, 5 -экзонуклеаза фага Я, экзонуклеаза IIIЕ. соН, рибонуклеазы, метилазы и др. [c.28]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология