Гель-электрофорез в крахмальном

Рис. 3-6. Электрофоретическое разделение белков плгрмы человека пятью различными методами при pH 8. а — электрофорез без носителя б — электрофорез на бумаге в — электрофорез в крахмальном геле г — электрофорез в полиакриламидном геле д — иммуноэлектрофорез (полосы прештитации к поливалентной антисыворотке человека). Стрелки показывают положение отдельных белков плазмы.

Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми разными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюлозы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод, в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду его называют методом электрофоретического молекулярного сита 127, 128]. [c.164]

После электрофореза крахмальный гель необходимо разрезать вдоль, так как краси тель не проникает в целую пластину. Уникальное преимущество крахмального геля состоит именно в том, что его относительно легко разрезать на узкие полосы. Это дает возможность одновременно определять в одном опыте различные ферментативные ак- [c.72]

С помощью гель-электрофореза молекулы, имеющие в иных условиях близкие электрофоретические подвижности, разделяются по их размерам. Первоначально для этой цели использовали крахмальный гель [128], который и до сих пор применяется в аналитических целях. Однако крахмальный гель никогда не удавалось успешно использовать в препаративных масштабах. Универсальным средством для анализа белков (а теперь и нуклеиновых кислот) в биохимических лабораториях стал полиакриламидный гель [129]. Он также пригоден и для препаративного электрофореза. Поскольку этот гель, представляющий собой трехмерную сетку нитей, образующих поры разных размеров [130], обладает разной эффективной вязкостью в зависимости от размеров молекул, уравнение (5.2) для электро- [c.215]

Крахмальные гели, содержащие мочевину, тоже дают удовлетворительные результаты при электрофорезе, и с ними легче работать, чем с полиакриламидными гелями. Хотя крахмальные гели в присутствии мочевины прозрачны, они становятся мутными после удаления мочевины во время их окрашивания и отмывания. Поэтому окрашенные зоны белков видны только на поверхности гелей. [c.320]

Гели. Агаровые, крахмальные, полиакриламидные и другие гели следует готовить непосредственно перед использованием, а это зачастую процесс, требующий времени. Свойства гелей таковы, что и адсорбция, и электроосмос, и расширение зон в результате диффузии очень незначительны. Гель-электрофорез применяется и для препаративных целей, но гораздо более широко используется как аналитический метод и особенно ценен для разделения смесей веществ, имеющих одинаковые заряды, но слегка различающиеся массы. [c.122]

При электрофорезе в кислой среде на крахмальном или полиакриламидном геле глиадины делятся по подвижности на а-, -, у- и СО-группы, каждая яз к-рых включает неск. белков. Гордеины делятся на С и В группы. Причем малоподвижные белки группы В-это S-бедные П. Глютенины при обычных условиях электрофореза остаются на старте. При двухмерном электрофорезе глиадинов выделено более 50 компонентов, причем разные сорта пшеницы существенно различаются по составу белков, относящихся к П. [c.100]

Полиакриламидный гель заменил крахмальный гель потому, что при его использовании можно контролировать эффект молекулярного сита с помощью изменения концентрации геля, а адсорбция белков в нем весьма мала. Полиакриламид — наиболее эффективный носитель для электрофореза белков и небольших молекул РНК. (Для нуклеиновых кислот, размер молекул которых больше размера пор полиакриламида, лучше использовать агарозу или агарозу — акриламид.) Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида Ы,Ы -метилен-бис-акрила- [c.229]

Ситуация изменилась в середине 60-х гг. после внедрения в исследовательскую практику метода гель-электрофореза белков. Суть его заключается в разделении в полиакриламидном (или крахмальном) геле родственных белков (изозимов), чьи электрофоретические подвижности различаются из-за мутационной замены отдельных аминокислотных остатков. Использование этого метода показало, что примерно треть всех локусов, контролирующих биохимические реакции, находится в полиморфном состоянии. При этом средняя гетерозиготность колеблется от 7% у человека до 42% у дрозофилы. [c.178]

Электрофорез применяют для очистки различных фармацевтических препаратов. В Фармакопее СССР (изд. 10) предусмотрено установление степени чистоты по электрофоретической однородности ряда антибиотиков, витаминов и других веществ. Электрофорез (ионофорез) является одним из методов введения лечебных препаратов в организм человека. Широкое применение как аналитический и препаративный метод разделения и выделения различных лекарственных веществ и биологически активных соединений нашел электрофорез на бумаге, а также в агаровом или крахмальном геле. Эти методы применяют также при диагностике ряда заболеваний путем сравнения фракционного состава (по числу и интенсивности зон на электрофореграмме) нормальных и патологических биологических жидкостей. [c.408]

При электрофорезе в поддерживающих средах наблюдается и электроосмос, влияющий на разделение белковых фракций, особенно если электрофорез проводить не на бумаге, а в агаровом или крахмальном геле. [c.191]

Различают свободный электрофорез и электрофорез в поддерживающих средах. При свободном электрофорезе изучаемую смесь белков помещают в буферный раствор, контактирующий с электродами. Установка для свободного электрофореза сложна она имеет фотооптическую систему для регистрации результатов разделения белковой смеси. Второй тип электрофореза предусматривает использование поддерживающих сред (специальной хроматографической бумаги, ацетатной целлюлозы, агарового или крахмального геля и т. п.), которые сначала пропитывают буферными растворами, а затем помещают на них исследуемую белковую смесь. Концы бумажных полос, агаровых или крахмальных блоков и т. п. контактируют обычно с буферным раствором, в который погружены электроды, соединенные с источником постоянного электрического тока (рис. 95 [c.218]

В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе на бумаге можно обнаружить 5 фракций альбумины, О -, а,-, 3-, у-глобулины. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выделяют 7— 8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле—до 16—17 фракций. Следует помнить, что терминология белковых фракций, получаемых при различных видах электрофореза, еще окончательно не установилась. При изменении условий электрофореза, а также при электрофорезе в различных средах (например, в крахмальном или полиакриламидном геле) скорость миграции и, следовательно, порядок белковых зон могут меняться. [c.569]

Диффузионные качества гелей, как об этом указывалось ранее (см. стр. 218), широко используются в лабораторной практике для электрофореза белков. Электрофорез в агаровом или крахмальном геле имеет определенные преимущества по сравнению с электрофорезом на бумаге, так как при этом выявляется большее количество и более четкое разделение белковых фракций как в нормальных, так и в патологических сыворотках крови. [c.240]

Электрофорезом в крахмальном геле удалось продемонстрировать, что альбумины пшеницы состоят, по крайней мере, из 21 компонента с разными свойствами. По своему аминокислотному составу они четко отличаются от проламинов и глютелинов. [c.181]

Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5—6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3—0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двумерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта — простота исполнения, вертикального — большая разрешающая сила. [c.147]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КРАХМАЛЬНОМ ГЕЛЕ [c.12]

Существует три типа электрофоретических систем электрофорез по Тизелиусу (с подвижной границей) зональный электрофорез (например, в среде с капиллярной структурой) стационарный электрофорез (изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез). В медицинской и фармацевтической практике чаще применяется зональный электрофорез на фильтровальной бумаге, пленке из ацетатцел-люлозы, агаровом, агарозном, крахмальном или полиакриламидном гелях. Электрофорез белков сыворотки крови ведут в буферной среде с pH 8,6, когда молекулы белка и липопротеинов заряжаются отрицательно и движутся к аноду. После заверщения электрофоретического разделения электрофореграммы фиксируются и окрашиваются. Затем производят визуальную и денситометрическую оценку разделения белков. Для окраски различных белков на электрофоре-граммах используют специальные красители, часть из которых представлена в табл. 5. [c.44]

Некоторые методические сложности препятствуют широкому распространению электрофореза в крахмальном геле, несмотря на его весьма большую разрешающую способность. По сравнению с электрофорезом на бумаге электрофорез в крахмальном геле включает дополнительные операции, связанные с приготовлением и гидролизом крахмала, сборкой прибора, окрашиванием и количественным определением полученных фракций. Однако присущий крахмальному гелю эффект молекулярного сита увеличивает разрешающую способность данного метода по сравнению с электрофорезом на бумаге, и поэтому его используют для более тонкого анализа. [c.12]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Электрофорез. Электрофорез в крахмальном геле продолжается 14—18 ч при градиенте напряжения 6 В/см. [c.80]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

Иммунохимическая характеристика разделенных компонентов возможна и в том случае, если электрофорез проводят в крахмальном геле. После электрофореза крахмальный гель разрезают обычным способом на тонкие пластинки (желательно толщиной не более 0,3 мм), а пластинки — на полоски, соответствующие электрофоретически разделенным антигенам. Полоски переносят на стеклянные пластинки и заливают их теплым агаровым золем. Затем на определенном расстоянии от полоски крахмального геля и параллельно ей вырезают канавки для ан- [c.243]

В 1966 г. появились первые сообщения об использовании при электрофорезе крахмального геля в первом направлении и агарозного — во втором [725, 744]. Фагерхол и Лорелл [356] описали сочетание диск-электрофореза в крахмальном геле с электрофорезом в агарозном геле, содержащем антитела к антитрипсину, причем они обнаружили 12 хорошо разделившихся фенотипических вариантов (см. рис. 106). Крахмальный гель разрезали в горизонтальном направлении и из нижнего слоя (толщиной 2 мм) вырезали полоски шириной 2 мм, которые помещали в канавки, сделанные в геле, содержащем антитела. Пространство между краями крахмального и агарозного гелей заполняли жидкой агарозой, нагретой до 45 С. [c.260]

Зоны трансферрина выявляют путем насыщения сыворотки перед электрофорезом ионами 5эреЗ+ ц радиоавтографии полученных электрофореграмм. По методу Гиблетта и др. [433] перед электрофорезом к 1 мл сыворотки добавляют 5 мкКи РеС1з. После электрофореза крахмальные гели разрезают на отдельные фрагменты, которые завертывают в прозрачный материал, помещают на подходящую рентгеновскую пленку и экспонируют в течение 12 ч. При более длительной экспозиции для предотвращения диффузии необходимо замораживать гель и проводить радиоавтографию при глубоком охлаждении. [c.346]

Один из способов идентификации нужного фермента среди многих компонентов, разделившихся в процессе электрофореза, состоит в специфическом окрашивании этого фермента. Естественно, такой способ можно применять только в тех случаях, когда электрофорез проводят в неденатурирующих условиях и, следовательно, он не пригоден для выявления ферментов после электрофореза в присутствии мочевины или ДСН. Кроме того, процедуру идентификации фермента следует проводить без предварительной фиксации белковых полос, и тем не менее используемые реагенты должны успеть продиффундировать в гель прежде, чем произойдет диффузия самого фермента. Наиболее удовлетворительные результаты дают те методы, в которых гель разрезается по толщине на тонкие пластины (рис. 9.6), благодаря чему полосы белков оказываются на поверхности и необходимость в длительной диффузии реагентов в гель отпадает. Лучше всего для этого подходят крахмальные или полиакриламидные (толстые) пластины после проведения простого гель-электрофореза, электрофореза в градиентных гелях н изоэлектрического фокусирования. [c.327]

Молекулярное сито. Свойствами молекулярного сита обладает применяемый в гель-электрофорезе полужесткий носитель (гель) такие его сюйства способствуют разделению смесей заряженных макромолекул, например белков, которые различаются не только по электрофоретической подвижности, но также формой и размерами. Гели состоят из беспорядочно переплетающихся молекулярных цепей, распределенных по всему объему геля и образующих ситоподобную структуру. В соответствии с конкретными требованиями разделения размер пор гелей можно варьировать в некоторых пределах. Принцип действия молекулярного сита в агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях заключается в том, что крупные молекулы движутся сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор, который определяется числом поперечных сшивок в геле. При использовании гелей типа сефадекса ситуация обратная— в соответствии со спецификой их природы миграция малых молекул тормозится сильнее, чем крупных (разд. 3.7.2). [c.119]

Применение в качестве носителей гелей значительно расширило возможности этого метода и сферу его применения. Большим преимуществом метода является возможность варьирования степени иористости геля, что позволяет улучшать разделение молекул, обладающих близкими зарядами, но различающихся по размерам и (или) форме. Вследствие этого гель-электрофорез чрезвычайно удобен для разделения смесей нуклеиновых кислот (особенно молекул РНК) и белков (включая ферменты, изоферменты и структурные белки). Степень пористости крахмальных и агаровых гелей не удается контролировать до такой степени, как полиакриламидных, но они также оказались весьма полезными при разделении смесей различных высокомолекулярных соединений. [c.137]

Первоначально для гель-электрофореза применяли крахмаль-ный гель. На рис. 9.4 изображено типичное устройство для электрофореза в крахмальном геле. Гель представляет собой пасту из картофельного крахмала, зерна которого разрушены нагреванием в буфере. При горизонтальном положении геля, как показано на рисунке, образец наносится в пхель, прорезанную лезвием бритвы, в виде раствора или смеси с зернами крахмала. Щель заливают воском или жиром, после чего прикладывают напряжение. После окончания электрофореза полутвердый гель отделяют и часто разрезают на два или три слоя, каждый из которых окрашивается различным способом. Разнообразные компоненты проявляются в геле в виде серии полос (рис. 9-5). В настояш ее время крахмальный гель используется редко, поскольку более удобным оказался полиакриламидный гель. [c.229]

Подобно крахмальному и акриламидному агаровый гель является очень мягким носителем в отличие от электрофореза на бумаге при нем не происходит инактивации белков, что позволяет определять активность отдельных фракций бeлкОДJieпo peд твeннo в геле после проведения электрофореза. Приготовление агарового геля значительно проще, чем крахмального или полиакриламидного, продолжительность электрофореза составляет I—4 ч. [c.92]

Поддерживающей средой для электрофореза могут служить фильтровальная бумага, крахмальный или агаровый гели, аце-тат-целлюлозная мембрана, полиакриламидный гель и т. д. Создаваемое в смоченной буферным раствором поддерживающей среде электрическое поле заставляет различные компоненты смеси белков двигаться в определенном направлении со скоростью, соответствующей заряду молекул, что приводит к их разделению. Если электрофорез происходит в крахмальном или полиакриламидном геле, то разделение зависит не только от заряда, но и от величины и формы молекул, так как в этом случае поддерживающая среда выполняет роль молекулярного сита. При электрофорезе в щелочном буферном растворе белки сыворотки крови разделяются по меньшей мере на 5 фракций. При ионной силе 0,1 и pH 8—9 быстрее всех к аноду движется альбумин. За ним следуют в порядке уменьшения скорости миграции а-1-, а-2-, р- и 7-глобулиновые фракции. Подбирая соответствующую поддерживающую среду и буферный раствор, можно улучшить разделение. Поэтому даже в сравнительно малооснащенной больничной или клинической лаборатории зональный электрофорез позволяет проанализировать белки более детально, чем свободный. [c.10]

При электрофорезе в крахмальном геле фракция альбуминов у некоторых людей иногда делится на две (альбумин А и альбумин В), т.е. у таких людей имеется два независимых генетических локуса, контролирующих синтез альбуминов. Добавочная фракция (альбумин В) отличается от обычного сывороточного альбумина тем, что молекулы этого белка содержат два остатка дикарбоновых аминокислот или более, замещающих в полипептидной цепи обычного альбумина остатки тирозина или цистеина. Существуют и другие редкие варианты альбумина (альбумин Ридинг, альбумин Джент, альбумин Маки). Наследование полиморфизма альбуминов происходит по аутосомному кодоминантному типу и наблюдается в нескольких поколениях. [c.570]

Глобулины. Сывороточные глобулины при высаливании нейтральными солями можно разделить на 2 фракции —эуглобулины и псевдоглобулины. Фракция эуглобулинов в основном состоит из у-глобулинов, а фракция псевдоглобулинов включает а-, 3- и углобулины, которые при электрофорезе, особенно в крахмальном или полиакриламидном геле, способны разделяться на ряд подфракций. а- и 3-Глобулиновые фракции содержат липопротеины, а также белки, связанные с металлами. Большая часть антител, содержащихся в сыворотке, находится во фракции у-глобулинов. При снижении уровня белков этой фракции резко понижаются защитные силы организма. [c.571]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Повышенная разрешающая способность электрофореза в крахмальном геле позволяет делить смесь белков на еще большее число компонентов. Вместо 5 классических фракций сыворотки можно получить 8—10 фракций. Более того, с помощью элекрофореза в крахмальном геле можно выделить несколько разных компонентов из препарата, который по данным других методов разделения считался гомогенным. Примеры такого рода встречаются при анализе миеломных белков. При электрофорезе на бумаге, ацетат-цел-люлозной мембране или в агаровом геле миеломные белки, относящиеся к IgG- и IgA-типам, образуют гомогенные зоны. Однако иногда в сыворотке больного можно обнаружить неоднородные фракции миеломных белков, например в случае мультиклональной миеломы или миеломы с агрегирующим белком IgA. Микрогетерогенность таких миеломных белков хорошо выявляется при электрофорезе в крахмальном геле. Вместо картины гомогенности, которую они дают при других постановках электрофореза, при разделении в крахмальном геле можно видеть несколько четко разграниченных зон [17]. [c.13]

Электрофорез в крахмальном геле имеет не только большое значение при диагностике парапротеинемий он весьма важен при определении гомогенности нативных белков и полезен при анализе субъединичной структуры молекулы белка. Например, папаиновые фрагменты IgG (Fab, F и F ) или выделенные из него полипептид-ные цепи (Н- и L-цепи) при электрофорезе в крахмальном геле образуют отдельные зоны. Это позволяет сравнивать субъединицы гомогенных IgG (миеломных белков или чистых антител) между собой. [c.13]

Фиг. 7. Прибор для электрофореза в крахмальном геле (по Смитису [26]).

В которую переходят из крахмала растворимые примеси, отбрасывают. Отмывание крахмала отстаиванием повторяют дважды, затем осадок переносят в воронку Бюхнера и 3—4 раза промывают буферным раствором. После этого делают пастоподобную смесь крахмала с буферным раствором и примерно 100 мл этой пасты переносят в коническую колбу емкостью 0,5 л. Постоянно размешивая, крахмальную пасту нагревают до получения абсолютно гомогенной массы, причем следует избегать кипения геля. Чтобы удалить пузырьки воздуха, в колбе, содер-жаш ей нагретый гомогенный крахмальный гель, с помош ью вакуумного насоса создают разрежение, и гель на 1—2 мин вскипает. После этого им заполняют ванну прибора для электрофореза избыток буферного раствора удаляют с помош ью толстой фильтровальной бумаги, а для того чтобы предотвратить испарение, поверхность геля заливают тонким слоем расплавленного парафина. [c.79]

Локализация белковых фракций. Закончив электрофорез, ъанну с крахмальным гелем извлекают из прибора и располагают горизонтально на столе. Пленку парафина, закрывающую гель, удаляют, и всю поверхность крахмала покрывают листом фильтровальной бумаги. Лист плотно прижимают к поверхности геля в течение 5 мин, затем снимают его, высушивают в сушильном шкафу при 100 С и окрашивают белковыми красителями (см. стр. 54). Этим способом удается установить локализацию фракций, не прибегая к окрашиванию самого крахмального геля (метод отпечатков), [c.80]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология