Вектор универсальный для клонирования в oli

К определению нуклеотидной последовательности ДНК данные участки фаговых промоторов все же имеют некоторое отношение, хотя и не являются обязательными. Так, кроме широко применяемых универсальных прямого или обратного праймеров, иногда используют олигонуклеотидные праймеры, комплементарные данным фаговым промоторам. Главной причиной их использования является то, что они расположены несколько ближе к полилинкеру и соответственно уменьшается количество не нужных для чтения нуклеотидов самого вектора до начала вставки и, таким образом, увеличивается количество определенных нуклеотидов в клонированном фрагменте ДНК. [c.218]

Рис. 27. Универсальный вектор для клонирования Blus ribe М13 Внизу представлена последовательность оснований в полилинкере

Клонируемый ген встраивают в N ol-, Pst -или // иёШ-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосомы и сайтами терминации транскрипции. Если его рамка считывания не попадает в ногу с кодоном AUG, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клонированного гена. Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевой участок белка-мищени, у разных клонированных генов неодинакова, нельзя создать универсальный вектор, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому ни одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га- [c.121]

ЦЫ В присутствии подходящих хелперных компонентов. Подобные векторы по сравнению с векторами других типов имеют важные преимущества — простоту, и, судя по нащему опыту, позволяют получать вирусные препараты со стабильно высоким титром и устойчивой экспрессией клонированного гена. Более сложные векторные системы могут оказаться более универсальными, однако часто их использованпе наталкивается на трудности, связанные с исстабильностью или низким уровнем экспрессии. [c.280]

ВекторыpGEM. Описанные плазмидные векторы пригодны лишь для клонирования генов в клетках Е. соН и родственных им грамотрицательных бактерий, например. Salmonella и Serratia. Они универсальны — их используют для самых разнообразных целей. В то же время сконструировано много специальных векторов, приспособленных, например, только для идентификации регуляторных сигналов, для суперпродукции чужеродных белков и их секреции, для секвенирования ДНК, экспрессии генов животных в [c.201]

На рис. 26 приведен один из векторов на основе фага М13. Следует отметить, что для репликации этого фага используется весь его геном, за исключением небольшой области (507 и.о.), названной межгенной последовательностью. Именно только ь эту область можно встроить чужеродную ДНК. Обычко вставляют полилинкер (рис. 27), что делает вектор более универсальным, так как появляется возможность применять для клонирования разные рестриктазы. В приведенном на рисунке векторе и во многих других в межгенной области находится N-концевой участок гена -галактозидазы со встроенным в него полилинкером. [c.152]

Рис. 2 дает представление о размерах хромосомных сегментов, в пределах которых работают различные современные методы генетических исследований. Ось ординат представляет собой логарифмическую шкалу физических расстояний, измеренных в парах (или в тысячах пар) нуклеотидов (п.н. или т.п.н,). На шкале приведены и значения генетических расстояний, измеряемые в сантиморганидах (сМ). 1 сМ приблизительно равна 10 п. н. Однако это соотношение нельзя считать универсальным, ибо зависимость между генетическим и физическим расстоянием на хромосоме имеет нелинейный характер, на нее могут оказывать влияние горячие точки рекомбинации. Наличие таких областей может привести к ситуации, когда сравнительно большому генетическому расстоянию соответствует небольшой отрезок на физической карте. В то же время в геноме существуют участки, рекомбинация в которых маловероятна, а это приводит к обратной ситуации. Как показано на рис. 2, классические методы молекулярной генетики хорошо работают на последовательностях длиной до 50 г. п. н., что соответствует максимальному размеру вставки в космидный вектор. Участки большей длины можно клонировать путем прогулки по хромосоме , когда, используя уже клонированные последовательности, геномную библиотеку скринируют с целью получения перекрывающихся клонов. Таким способом удаётся анализировать последовательности длиной до нескольких сотен т. п. н. Однако, в [c.96]

Во многих трансформирующих векторах присутствуют только один или два удобных рестрикционных сайта для клонирования, тогда как другие более универсальны и содержат ряд удобных сайтов в полилинкере, иногда расположенном в области а-комплементации -галактозидазы, что позволяет обнаружить трансформированные рекомбинантные бактериальные клоны на чашках с X-GAL/ИПТГ (табл. 1.1 и 1.2). [c.35]

Недавно разработанные системы направленного мутагенеза с использованием ПЦР и мегапраймеров позволяют существенно облегчить процесс получения мутаций, что достигается отказом от использования перекрывающихся мутантных праймеров для синтеза мутантных фрагментов ДНК [25, 26]. Принцип этого метода заключается в следующем (рис. 36,а). В первом раунде ПЦР синтезируют мутантный фрагмент ДНК, в который вводят мутации с помощью одного из праймеров (праймер М). Поскольку образующийся продукт ПЦР обладает значительными размерами (его допустимые размеры 70-800 п.о.) и используется в качестве праймера в следующем раунде ПЦР, он получил название мегапраймера. Фрагмент очищают электрофорезом в агарозном геле и используют в качестве праймера во втором раунде репликации со встречным праймером А. Праймеры А и В могут быть универсальными и содержат на своих 5 -концах сайты рестрикции для дальнейшего клонирования фрагмента. Конечный продукт ПЦР, образовавшийся после второго раунда амплификации, длина которого может быть в пределах 400-2500 и.о., после очистки и инкубации с соответствующими рестриктазами клонируют в подготовленном векторе, заменяя исходный фрагмент ДНК на мутантный, полученный с использованием мегапраймера. [c.298]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология