Праймеры для обратной транскриптазы

Начиная с этого момента, обратная транскриптаза начинает циклически синтезировать цепи ДНК на РНК-матрицах, расщеплять молекулы РНК в гибридах и превращать их в двухцепочечные молекулы, которые, в свою очередь, начинают служить матрицами для Т7-РНК-полимеразы для синтеза новых копий одноцепочечных РНК. Замечательным свойством данной системы является возможность осуществления всех этих реакций одновременно и при одной постоянной температуре. В итоге имеет место самоподдерживающаяся амплификация исходной последовательности РНК, специфичность которой задается первичной структурой используемых праймеров. [c.243]

С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРИК, выбрав для этого подходящий праймер. Эта возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка гена. Но можно получить и набор генных фрагментов, если использовать в качестве праймеров произвольные олигонуклеотиды, получаемые, например, в результате гидролиза ДНК тимуса теленка панкреатической ДНКазой. Их разнообразие столь велико, что среди них имеются комплементарные последовательности к любому из участков мРИК (или ДНК). Добавление в реакционную смесь суммарной фракции таких праймеров дает возможность получить в наборе J HK копии всех участков анализируемого гена. Они полезны для использования их в качестве гибридизационных зондов, применяемых для поиска определенных клонов в банках генов (см. гл. 9). [c.182]

I или обратной транскриптазы. На этом этапе праймер не нужен, поскольку на З -конце первой структуры временно образуется шпилька варьирующей длины, которая и служит праймером. На последнем этапе эту шпильку разрезают с помощью нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК, и получают дуплексную р ЦНК. [c.285]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как. множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной транскриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК- [c.40]

Механизм действия ДНК-полимераз эукариот подобен таковому у прокариот. Отличия в процессе репликации заключаются в следующем хромосома эукариот имеет линейную структуру, на обеих цепях расположено множество репликонов и соответствующее количество терминаторов. Линейность ДНК эукариот является причиной проблем, которых не существует у прокариот, имеющих кольцевую ДНК. В отличие от лидирующей цепи, которая реплицируется полностью, праймер, находящийся у З -конца отстающей цепи, разрушается и не реплицируется при помощи ДНК-полимераз. Для предотвращения укорачивания цепи на концах хромосомы находятся теломеры — участки нереплицируемой ДНК. На этом участке ДНК может синтезироваться праймер, и полнота репликации сохранится. Теломера состоит из большого числа повторов, например у человека ТТАГГГ. Матрицей для теломеры является РНК, а специальный фермент теломераза, представляющий собой обратную транскриптазу, присоединяет эти фрагменты к З -концу для сохранения исходных размеров хромосомы. [c.453]

Интересен способ получения из двуцепочечного ПЦР-продукта одноцепочечной матрицы, пригодной для ее секвенирования обратной транскриптазой [Stoflet et al., 1988]. Особенностью этого метода является то, что матрица представляет собой РНК-копию ПЦР-фрагмента ДНК. Такое становится возможным благодаря специальному праймеру (одному из пары амплификационных), несущему, кроме комплементарной последовательности к секвенируемому фрагменту ДНК, участок промотора фагов Т7, или ТЗ, или SP6 [Lind et al., 1996]. Таким образом, после завершения самой ПЦР в реакционную смесь добавляется фермент Т7 РНК-полимераза, способная за короткий промежуток времени наработать значительное число молекул РНК, представляющих собой, в-данном случае, матрицы для секвенирования (рис. 3.4). [c.147]

Другую разновидность внутреннего введения метки можно представить как возможность мечения уже самого праймера по его 3 -концу флуоресцеин-15-дАТФ за счет использования 3 —> 5 -экзонуклеазной активности нативной Т7 ДНК-полимеразы, способной в отсутствие остальных дНТФ провести обменную реакцию при условии, что концевой нуклеотид праймера будет тот же дАМФ. Добавление различных флуоресцентных красителей к 3 -концу праймера путем его ферментативного удлинения с помощью дУТФ с пришитыми флуорофорами показало, что ряд ДНК-полимераз (Кленовский фрагмент ДНК-поли-меразы I, обратная транскриптаза и некоторые другие) способны эффективно включать подобные объемные соединения, которые, в свою очередь, не препятствуют дальнейшему синтезу комплементарной цепи ДНК [Александрова и др., 1990]. Упомянутая выше обменная реакция, осуществляемая за счет 3 —> 5 -экзонуклеазной активности нативной Т7 ДНК-полимеразы, приводила, по существу, к образованию флуорес- [c.315]

Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-мат-рицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок — праймер. Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с но-восинтезированной цепью ДНК. [c.26]

Синтез полидезоксинуклеотида с помощью химического и ферментативного методов. Две частично комплементарные цепи (верхняя часть рисунка) синтезированы химическим методом и подвергнуты отжигу. Образовавшийся несовершенный дуплекс используется в качестве матрицы и праймера для синтеза полностью дуплексной молекулы с помошью ДНК-полимеразы I oli или обратной транскриптазы. [c.286]

Удлинение праймера исследование родства между внутриклеточной РНК и клонированным фрагментом ДНК с помощью обратной транскриптазы. Для проведения этого эксперимента необходим относительно короткий ДНК-зонд, который гибрици-зуется с участком РНК, желательно находящимся на расстоянии не более 100 п оснований от предполагаемого 5 -конца РНК (рис. 7.42). ДНК-зонд отжигают с РНК, и он играет роль праймера при обратной транскрипции, а матрицей служит РНК. Поскольку обратная транс1фиптаза прекращает копирование, когда достигает 5 -конца РНК, размер продукта позволяет установить, где начинается РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно меченным, что позволяет легко определить положение продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен только к конкретной РНК, исследуемый препарат может представлять собой смесь разных РНК. [c.353]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология