Аффинная элюция с ионообменника

АФФИННАЯ ЭЛЮЦИЯ С ИОНООБМЕННИКА [c.451]

АФФИННАЯ ЭЛЮЦИЯ С ИОНООБМЕННИКОВ И ДРУГИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ АДСОРБЕНТОВ [c.133]

Рис. 4.22. Принципы аффинной элюции с катионообменника. А. Положительно заряженный белок адсорбируется на ионообменнике. Б. Введен отрицательно заряженный лиганд, который при связывании с белком уменьшает его общий заряд. В. Белок элюируется, так как величина а уменьшается благодаря снижению общего заряда белка.

На рис. 4.22, 4.23 и 4.24 схематически представлены основные принципы аффинной элюции с ионообменников. Фермент [c.134]

Из-за ограничений, указанных в пункте а, и ввиду того, что практически все лиганды (за исключением ионов металлов) отрицательно заряжены, аффинная элюция с ионообменников осуществляется только применительно к нейтральным и основным белкам, которые адсорбируются на катионообменнике при нейтральных значениях pH (6—8). Аффинная элюция (ионами Мд +) наблюдалась в процессе очистки пируваткиназы, адсор- [c.138]

Фосфоцеллюлоза представляет собой один из ионообменников, применявшихся во многих опубликованных работах по проведению аффинной элюции. Однако при использовании фосфоцеллюлозы наблюдаются специфические эффекты, особенно ес- [c.144]

Теоретически существуют два общих метода элюции белков-(не считая аффинной элюции, разд. 4.4) а) изменение pH буфера до величины, при которой связывание белка с адсорбентом ослабевает для анионообменников используют более низкие значения pH, а для катионообменников — более высокие б) повышение ионной силы, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом. На практике метод а не всегда дает хорошие результаты. Это объясняется тем, что цри недостаточно высокой буферной емкости резкое и значительное изменение pH по мере элюции белков приводит к плохому разделению индивидуальных компонентов. При-низкой ионной силе буферная емкость должна быть низкой, и попытка изменить значение pH, используя градиент pH, оказывается тщетной из-за буферной силы белков, адсорбированных на колонке, а в случае использования ДЭАЭ-адсорбентов— из-за буферных свойств самого адсорбента. Типичный результат показан на рис. 4.12. Градиент pH может быть успешно использован только тогда, когда интересующие нас белки первыми и очень прочно адсорбируются на ионообменнике. В этом случае можно использовать сильное забуферивание растворов при ионной силе 0,1 и больше. В одной из работ [29] была предложена схема получения сильных буферных градиентов pH при постоянной ионной силе. [c.113]

Порат [68, 69] ввел в употребление диполярные ионообмен- ники (см. также разд. 4.8), обладающие высргкими адсорбционными емкостями, но по своему поведению несколько отличающиеся от ионообменников. Они содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы. Изучение этих адсорбентов с целью их использования для аффинной элюции, по-видимому, 1будет оправдано. [c.146]

Некоторые ферменты необыкновенно устойчивы к инактивации, вызываемой любым из факторов, описанных в разд. 6.2. Часто это отмечается даже тогда, когда процедура очистки продолжается в течение нескольких недель. Внеклеточные ферменты отличаются большой устойчивостью потому, что 0Н1И существуют в более жестких природных условиях. В таких случаях быстрота операций не имеет большого значения, если решены проблемы протеолитической инактивации. Но в других случаях, когда стабильность фермента не столь велика, скорость опе раций может быть гораздо важнее, чем разрешегаие, достигаемое на каждом этапе, даже если это означает включение дополнительной стадии очистки для окончательного удаления из препарата примесей. При очистке нестабильных ферментов следует исключать диализ и гель-фильтрацию на медленно фильтрующих средах. Если это возможно, то одна стадия фракционирования должна следовать за другой без длительной подготовки. Так, после солевого фракционирования может идти гель-фильтрация, поскольку на этой стадии удаляется соль и в то же время происходит фракционирование белков. Но после солевого фракционирования нельзя сразу же использовать метод ионного обмена. Его можно применять только в исключительных случаях, когда соль, содержащаяся в осадке, не препятствует адсорбции нужного белка. Непосредственно после стадии ионного обмена невозможно использовать гель-фильтрацию, так как фракции нужно сконцентрировать, — очень редко при элюции с ионообменника получается острый пик, содержащий концентрированный раствор данного вещества (см., однако, обсуждение аффинной элюции в разд. 4.4 и х роматофокуси-рования в разд. 4.3). После фракционирования смеси с помощью органического растворителя может следовать ионный [c.266]

Первоначально эти группы служили удлиняющими мостиками для аффинных адсорбентов, однако затем было установлено, что они обладают неспецифическими адсорбционными свойствами благодаря своей мультифункциональной природе. Био-специфическая элюция с этих адсорбентов, называемых имфи-литами , в ряде случаев оказалась успешной [66, 67]. Интерпретация адсорбции и элюции при использовании имфилитов намного сложнее, чем в случае ионообменников, так как здесь совсем неизвестна подлинная природа связывания белка. Будучи потенциально полезными, эти адсорбенты были в значительной степени вытеснены окрашенными (т. е, связанными с красителями) адсорбентами, которые функционируют также за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий (разд. 3.6). Главную проблему представляет низкая адсорб- [c.145]

Описанный метод получил дальнейшее развитие, и на его основе был разработан прием аффинной хроматографии [122], который сводится к тому, что в буферный раствор добавляют лиганд, изменяющий адсорбционные характеристики. Будь то гидрофобные адсорбенты или агароза, принципы аффинной хроматографии остаются теми же, что и в случае использования более специфических адсорбентов (разд. 4.5) или ионообменников (разд. 4.4). Сначала в отсутствие лиганда находят условия, которых еще не вполне достаточно, чтобы вызвать нужный эффект (в данном случае элюцию). Затем добавляют лиганд, что слегка нарушает установившееся равновесие и приводит к ожидаемому эффекту. Важно, чтобы при добавлении лиганда происходило заметное изменение существенного для очистки свойства, в данном случае — гидрофобного взаимодействия. Лиганд должен сохранять способность связываться с ферментом в условиях, существующих в колонке, т. е. при высокой концентрации соли. Примером аффинного осаждения может служить очистка некоторых тРНК-аминотрансфераз [122] связывание крупной молекулы тРНК приводит к заметному снижению адсорбционной способности колонки, что позволяет осуществлять элюирование. [c.187]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология