Скрининг с помощью гибридизации

Скрининг с помощью гибридизации [c.64]

Три фильтра-реплики, полученные от каждого исходного фильтра (два набора на агаре L-амп, один на агаре HMF-1 амп), подращивают при 37°С до тех пор, пока диаметр колоний не станет равным 1 мм. Первые два набора используют для скрининга библиотеки с помощью гибридизации (см. ниже), в то время как третий набор, инкубированный в чашках с агаром HMF-1 амп, переносят в чашки с агаром HMF-2 амп и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Чашки кладут [c.26]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

С тем, чтобы продемонстрировать универсальность рассматриваемого генетического подхода, амплифицнрованные библиотеки были скринированы и с помощью гибридизации и генетическим способом. Полученные клоны оказались в этих случаях одинаковыми. Как уже упоминалось, генетическому подходу присущ определенный недостаток это необходимость амплификации, которая может привести к уменьшению полноты библиотеки и выделению идентичных клонов. Такой проблемы не возникает в случае гибридизационного скрининга первичных библиотек. Вероятность нежелательных последовательное- [c.82]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

После гибридизации гибридизационный раствор сливают и хранят при —20 °С. Его используют для повторного скрининга положительных колоний. Фильтр промывают в коробке двухлитровыми порциями подогретого буфера. Условия промывки можно варьировать. В большинстве случаев мы проводим промывку при 65°С два раза в растворе ЗХ55С, 0,1%-ного ДСН и два раза в растворе 1х55С, 0,1%-ного ДСН. Продолжительность каждой промывки составляет от 20 до 30 мин. Ее осуществляют при постоянном перемешивании на ротационной качалке, снабженной водяной баней. Радиоактивность фильтров после промывки определяют с помощью счетчика Гейгера. По завершении последней промывки она должна быть близка к фону. [c.29]

Наличие в геномах человека и шимпанзе последовательностей, имеющих частичное сходство с различными генами HIV-1, первоначально тестировали с помощью блот-гибридизации в мягких условиях, позволяющих выявлять последовательности, сходство которых с генами ВИЧ составляет от 60% и выше. В очень мягких условиях гибридизации геномных ДНК человека и шимпанзе с перекрывающимися генами tatirev наблюдали в основном диффузное распределение сигнала. При более жестких условиях отмывки фильтров диффузный гибридизационный сигнал уменьшался и были обнаружены дискретные положительные сигналы как с ДНК человека, так и с ДНК шимпанзе. Наличие дискретных гибридизующихся фрагментов не исключает существование и других последовательностей, имеющих сходство с генами tat/rev, которые представлены менее часто встречающимися фрагментами других размеров. Об этом свидетельствуют полуколичественные данные гибридизации в точках, согласно которым общее число tatlrev-no-добных элементов в геноме человека составляет около 10 . Сходное значение было получено и при скрининге тотальной библиотеки генов человека (102-103). Эти оценки совпадают с теми, которые можно рассчитать на основании данных гибридизации с фильтрами высокой плотности, на которых нанесен ранжированный банк генов хромосомы 19. Около десятка рекомбинантных космид гибридизовалось в мягких условиях с зондом tatirev. Учитывая, что хромосома 19 содержит примерно 1/50 часть генома, можно рассчитать, что общее количество тг/геу-подобных элементов в геноме человека составляет около 5 х Ю . [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология