Системы экспрессии рекомбинантных генов

Системы экспрессии рекомбинантных генов [c.168]

Много этапов различных преобразований информационных макромолекул и белков отделяют генетическую информацию, заключенную в конкретных генах, от ее реализации в соответствующих фенотипических признаках клеток и организма, которые обладают этой информацией. Такая реализация требует точной координации в функционировании многих генетических систем организма на всех основных уровнях экспрессии генов. Многоступенчатый и сложный характер регуляции функционирования генов, особенно у высших организмов, накладывает большие ограничения на возможности получения полноценной экспрессии рекомбинантных генов в гетерологичных искусственных генетических системах. [c.36]

В качестве примера рассмотрим три системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. соН, которые получили широкое распространение. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют хорошо изученную систему регуляторных элементов лактозного оперона [123], в другом - систему промотор-репрессор-оператор фага [124], в третьем - промоторы и РНК-полимеразы бактериофагов [125]. Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в первых двух случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуля- [c.108]

Продукция рекомбинантных белков в растениях имеет ряд потенциальных преимуществ перед другими системами экспрессии чужеродных генов. Растительные системы более дешевы по сравнению с культивированием в биореакторах (ферментерах). Все, что требуется для нормальной жизнедеятельности растений, — это минеральные соединения, содержащиеся в почве, вода, энергия солнечного света и углекислый газ. [c.468]

Как это ни парадоксально, но один из способов увеличения количества чужеродного белка, синтезируемого рекомбинантным микроорганизмом, состоит в поддержании уровня экспрессии его гена на среднем уровне (так, чтобы на долю продукта приходилось примерно 5% суммарного клеточного белка), но зато в максимальном увеличении плотности культуры. Микробиологическая система с 5%-ным уровнем экспрессии чужеродного белка и низкой метаболической нагрузкой, в которой плотность может достигать 40 г/л (масса сухого вещества), оказывается более [c.129]

Стабильные клетки-продуценты, созданные на основе амплификации рекомбинантных генов, позволяют получать рекомбинантные продукты в более высоких титрах по сравнению с клетками, адаптированными к быстрой кратковременной экспрессии рекомбинантных белков (клетки MEL или OS). Для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков во всех обсуждаемых системах необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры белка, который должен быть синтезирован, и конструировать экспрессирующие векторы в соответствии с требованиями, предъявляемыми теми или иными клетками. В ряде случаев предварительные исследования такого рода бывает удобнее провести в бесклеточных белоксинтезирующих системах, которые позволяют иногда получать даже препаративные количества рекомбинантных белков. [c.183]

Клонотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на М- или С-концах которых (см. ниже) присутствуют дополнительные последовательности аминокислот. В наиболее хорошо разработанной системе, позволяющей конструировать клонотеки пептидов генно-инженерными методами, используют не- [c.338]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Использование дрожжевых систем экспрессии в биотехнологии и научных исследованиях. Крупномасштабный синтез рекомбинантных белков является одной из основных целей, для достижения которой конструируются системы экспрессии рекомбинантных генов в клетках дрожжей [255]. Синтезируемые рекомбинантные белки могут накапливаться в цитоплазме клеток, после чего их выделяют по традиционной схеме с использованием многостадийной очистки из бесклеточных экстрактов, получаемых после разрушения клеток. Популярными также являются системы, обеспечивающие секрецию рекомбинантных белков в культуральную среду. В этом случае секрецию можно обеспечить, например, включением в рекомбинантный белок аминокислотной лидерной последовательности препро-а-фактора S. erevisiae, которая направляет синтезируемые молекулы в секреторные гранулы [256]. [c.173]

На основе Sa haromy es erevisiae созданы высокоэффективные системы экспрессии рекомбинантных генов и крупнотоннажного синтеза рекомбинантных белков человека, животных и растений, в том числе и рекомбинантных антител (см. раздел П.3.4) [257]. Кроме того, экспрессия рекомбинантных белков в этих клетках активно используется для улучшения свойств белков методами направленной эволюции с использованием клеточного дисплея (раздел П.2.3.2), изучения белок-белковых взаимодействий в дрожжевых л-гибридных системах (раздел П.2.3.4) и для множества других не менее важных целей. [c.174]

Интенсивные исследования последних лет принесли и продолжают приносить новые знания о механизмах, обеспечивающих высокоэффективную и высокоспецифическую экспрессию генов [15]. Эту информацию успешно используют для эффективной экспрессии рекомбинантных генов в гомологичном или гете-рологичном генетическом окружении [117]. После рассмотрения основных принципов конструирования векторов для клонирования ДНК можно перейти к обсуждению проблемы экспрессии клонированных генов в искусственных генетических системах. Именно экспрессия клонированных генов является одной из основных задач генной инженерии и биотехнологии. Действительно, функциональную роль отдельных генов и их частей в живом организме можно понять и оценить лишь на основании экспрессии этих последовательностей, т.е. по фенотипическому проявлению их потенциальных биологических возможностей. Кроме того, крупномасштабная наработка биотехнологических продуктов требует осуществления эффективной экспрессии конкретных генов в искусственно созданных условиях. Для получения полноценной экспрессии клонированных генов используют экспрессирующие векторные системы, принципы конструирования которых в настоящее время хорошо разработаны. [c.104]

Несмотря на определенные успехи в получении нативных рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках, эти системы экспрессии эукариотических генов в настоящее йремя еще далеки от совершенства. По-прежнему остается открытым вопрос о посттрансляционных модификациях рекомби- [c.123]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Выделение любого нового рекомбинантного гена, как правило, заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах, т.е. наработки в препаративном количестве полноценного в функциональном отношении рекомбинантного белка. В настоящее время имеется множество систем экспрессии рекомбинантных генов, среди которых наибольшее применение в биотехнологии находят модифицированные различным образом микроорганизмы. Поскольку такие системы не позволяют решить многих проблем, связанных с экспрессией эукариотических рекомбинантных генов, в том числе, осуществления посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков, в ряде случаев для решения этих проблем используют культивируемые клетки животных и растений. Для изучения механизмов экспрессии генов в лабораторных условиях большую пользу приносят так называемые пермеабилизованные культивируемые клетки с полупроницаемыми мембранами, что можно сделать в определенных условиях. Кроме того, незаменимыми помощниками молекулярных биологов и генетиков остаются бесклеточные белоксинтези-рующие системы, один из вариантов которых, а именно проточные системы, находит применение и в промышленном производстве пептидов. Принципы, лежащие в основе использования таких систем, будут кратко рассмотрены ниже. [c.168]

Соблюдение условий, необходимых для транскрипции и трансляции клонированных генов, как и в случае бактериальных систем экспрессии, еще не гарантирует высокий уровень синтеза кодируемого этим геном белкового продукта. Многие белки (и мРНК) нестабильны в клетках дрожжей. Так, проинсулин человека крайне нестабилен в дрожжевых системах экспрессии (это не относится к рекомбинантному интерферону а2). На эффективность экспрессии рекомбинантных генов в клетках дрожжей оказывает влияние множество до конца не изученных факторов, и оптимизация этого процесса при решении конкретных биотехнологических задач в каждом случае требует проведения специальных исследований. [c.173]

Прежде всего, это необходимость правильного фолдинга исследуемого полипептида в составе гибридной молекулы, что особенно проблематично в том случае, когда белок имеет небактериальное происхождение. Кроме того, рекомбинантный белок, будучи экспонированным на поверхности фаговых частиц, должен обладать достаточной стабильностью. Эти и многие другие проблемы, связанные с недостаточной эффективностью экспрессии гибридных генов в системе фагового дисплея, должны решаться с использованием общих подходов к оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных системах, рассмотренных в первой части книги. С помощью подходящих бактериальных штаммов и условий культивирования можно решать многие из этих проблем. Тем не менее, при отборе ферментов с требуемыми свойствами чаще всего приходится пользоваться оригинальными подходами, к счастью опирающимися в своей основе на общие принципы, которые будут кратко перечислены ниже. [c.345]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Бактерии, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, защищают собственную ДНК от расщепления с помощью ферментов, метилирующих те участки молекулы, с которыми связывается соответствующая эндонуклеаза рестрикции. Однако геном клетки-хозяина не защищен от рекомбинантной рестриктазы Fokl, и чтобы предотвратить гибель растущих клеток, синтез гибридного фермента подавляли, поместив ее ген под контроль системы экспрессии бактериофага Т7. [c.174]

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса (его исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие слизистые вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легюгх или желудочно-кишеч-ном тракте) пригодны для профилактики самьгх разных заболеваний холеры, брюшного тифа, фиппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса как системы доставки и экспрессии соответствуюхцего гена необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10 . Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность. [c.242]

Генетическая селекция in vivo может обеспечить способность организма к разложению специфического вещества. Однако подобные методики нуждаются в длительном периоде селекции (8—10 мес, как описано выше) и основываются на случайном наборе генетического материала для получения желаемой катаболической системы. Использование методов рекомбинантной ДНК дает экспериментатору возможность соединять вместе определенные катаболические последовательности и контролировать экспрессию специфических генов. Уровень экспрессии, определяемый in vivo, зависит от регуляторных механизмов, кодируемых плазмидными последовательностями, и мало что можно сделать, чтобы повлиять на выход отдельных ферментов. Однако можно получить повышенный уровень генного продукта, клонируя определенные гены в векторах по направлению транскрипции промоторных последовательностей. [c.334]

В первых экспрессирующих плазмидах для запуска транскрипции использовали сильные метаболические irp- или /ас-промоторы (рис. 4.1), а рекомбинантный ген встраивали за участком промотор-оператор. Однако при использовании систем метаболической регуляции, контролирующих работу этих оперонов, было обнаружено, что экспрессия плазмидных генов была скорее конституитивной, чем контролируемой [6], и в результате при выращивании клеток плазмиды утрачивались. Экспрессия контролируется лучше при использовании плазмид с терморегулируемой системой транскрипции [4], содержащих такие промоторы, как Pr и Pl, полученные из фага Я. Контроль работы таких промоторов может осуществляться температурочувствительным продуктом гена Я-репрессора с /ssz, денатурирующим при температуре выше 37 °С. Плазмида, содержащая Рд-промотор фага Я, изображена на рис. 4.2. Другая особенность этого век- [c.96]

За последнее десятилетие удалось осуществить молекулярное клонирование и характеризовать структуру множества генов млекопитающих. Функциональное содержание и механизмы регуляции этих генов исследуются теперь в экспериментах по переносу генетического материала. Рекомбинантные конструкции на основе последовательностей дикого типа или их мутантных производных вводят путем трансфекции в культивируемые клетки [I] для того, чтобы идентифицировать г ис-действующие регуляторные элементы и изучить физиологические последствия экспрессии генных продуктов. Однако,, даже если для интересующего гена и существует подходящая культивируемая тканевая система, возможности исследования генной экспрессии в таких экспериментах in vitro ограничены. В конце концов функции генов и закономерности их экспрессии следует изучать, исходя из сложности целого организма. Был разработан целый ряд методик, позволяющих вводить интересующие нас последовательности ДНК в клетки зародышевого пути мышей и других млекопитающих. Включившись в геном данного организма, такие чужеродные последовательности, называемые трансгенами, устойчиво наследуются в ряду поколений. Весьма важное значение имеет тот факт, что трансгены часто экспрессируются и вызывают изменения в системе тканевой специфичности, физиологических реакциях, а иногда во всей программе развития организма. Следовательно, открывается путь к изучению функциональной роли и регуляции экспрессии интересующих нас клонированных генов на уровне целого организма — в данном случае это так называемый трансгенный организм. [c.308]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

В клетках Е. соН (и других бактерий) транскрипция большинства генов носит регулируемый характер, что обеспечивается системой белков-репрессоров и активаторов, а также низкомолекулярных эффекторов, которые главным образом влияют на взаимодействие РНК-полимеразы с транскрибируемыми генами 119-121]. Необходимость регулирования экспрессии генов в генной инженерии диктуется прежде всего тем, что сверхэкспрессия клонированных генов в клетках-продуцентах рекомбинантных белков при использовании сильных конститутивных промоторов может отрицательно сказываться на их жизнеспособности, поскольку промежуточные и конечные продукты экспрессии часто обладают цитотоксическим действием [122]. В этом случае сверхэкспрессия клонированных генов сопровождается снижением скорости или даже полной остановкой роста бактериальных или иных клеток. Для предотвращения этих эффектов используются генно-инженерные конструкции, в которых экспрессия клонированных генов в значительной степени подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста культуры рекомбинантных клеток и может быть дерепрессирована в любой нужный момент времени. [c.108]

Эффективность системы экспрессии, основанной на клетках OS, зависит, в первую очередь, от природы рекомбинантного белка, которая определяет его чувствительность к внутриклеточным протеиназам, а также метода трансфекции, соотношения числа клеток и молекул рекомбинантных плазмид, используемых для трансфекции, и состава питательной среды. Пример экспрессирующей кассеты генов, используемой в этой системе, представлен на рис. 17, а. Такой фрагмент ДНК может быть интегрирован в подходящую коммерческую плазмиду, в частности, в экспрессирующий вектор рХМТЗ. [c.181]

Интерес к бакуловирусам как потенциальным переносчикам рекомбинантных генов и системам, обеспечивающим их экспрессию, возник после обнаружения их способности к синтезу большого количества вирусных белков на поздних стадиях инфекции. В частности, это касается вирусных полиэдрина и белка р10, гены которых находятся под контролем сильных поздних промоторов и которые могут быть удалены без ущерба для размножения вирусов. Поэтому замещение указанных генов рекомбинантными сопровождается усиленной экспрессией последних. [c.182]

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы [260]. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам. [c.185]

Напомним, что вирус осповакцины развивается в цитоплазме. Поэтому в рекомбинантных вирусах важно использовать для экспрессии чужеродных генов вирусные промоторы. С помощью вирусных РНК-полимераз они позволяют избегать различных процессов, которые происходят в ядре и которые затрудняют экспрессию — сплайсинг, полиаденилирование, тоанспорт через ядерную мембрану. На порядок эффективнее промоторы фага Т7, но в этом случае в клетке должна присутствовать система, экспрессирующая РНК-полимеразу этого фага. [c.402]

Смотреть страницы где упоминается термин Системы экспрессии рекомбинантных генов: [c.169] [c.100] [c.111] [c.116] [c.124] [c.135] [c.171] [c.173] [c.175] [c.179] [c.237] [c.77] [c.97] [c.115] [c.119] [c.170] [c.175] [c.178] [c.179] [c.295] [c.85]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология