Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации

Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации [c.17]

Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации. .............17 [c.402]

Природная способность агробактерий переносить определенные последовательности ДНК в растительный гено.м была использована при конструировании ряда векторов для трансформации растений с учетом различных особенностей процесса трансформации под действием агробактерий. В начале 80-х годов многие группы исследователей модифицировали Ti-плазмиды таким образом, чтобы удалить все онкогены Т-ДНК. При этом было обнаружено, что кодируемые Ti-плазмидой онкогены не участвуют ни в переносе Т-ДНК в растительную клетку, ни в ее интеграции с ядерной ДНК. Следовательно, эти гены можно заменить, встроив вместо них чужеродную ДНК. При этом плазмида теряет онкогенные свойства. Следует, однако, отметить, что nos- или o s-гены представляют собой удобные маркеры для трансформации, поскольку ферментативную активность их продуктов легко тестировать. До настоящего времени не сообщалось [c.17]

Т-ДНК Тг-плазмид как природные векторы. Как уже отмечалось (см. гл. 3), в естественных условиях двудольные растения подвергаются трансформации Ti- и Ri-плазмидами агробактерий. Трансформированные Ti-ПJIaзмидaми ютетки становятся опу-.голевыми и образуют корончатые галлы (см. гл 5). В изолированном виде такие клетки размножаются без фитогормонов, синтезируя опины, а в случае их прививки на здоровые растения также образуют корончатые галлы. [c.373]

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

Выделение малых плазмид в больших количествах из . o/i — это важный этап любой серии манипуляций, имеющей целью встраивание генов в трансформирующие векторы растений. Плазмиды могут содержать ген, предназначенный для переноса, в специфичном рестрикционном фрагменте или могут быть частью векторной системы трансформации растений, например промежуточным вектором для коинтеграции с модифицированной плазмидой или бинарным вектором, способным реплицироваться в Е. oli и агробактериях. [c.42]

С тех пор как в 1962 г. были впервые сконструированы неонкогенные векторы, системы генетической трансформации, основанные на использовании агробактерий и компонентов Ti-и Ri-плазмид, были разработаны для сравнительно небольшого числа видов растений. Большинство фундаментальных исследований по контролю экспрессии нормальных, модифицированных или химерных растительных генов в трансгенных растениях проводилось на Ni otiana taba um. Это не случайность данный факт отражает ту простоту, с которой можно осуществлять манипуляции в культуре табака для получения как эффективной генетической трансформации, так и, что более важно, регенерации трансформированных растений. Хотя у большинства двудольных растений при заражении некоторыми онкогенными штаммами агробактерий образуются опухоли, остается проблема селекции тканей, трансформированных неонкогенной Т-ДНК, и еще большая проблема образования трансформированных побегов из таких тканей. Не следует забывать, что существует множество других подходов к проблеме переноса генов, особенно для однодольных растений, которые не основаны яа использовании агробактерий, и эти подходы обсуждаются в гл. 3. [c.87]

Поскольку физиологически и морфологически нормальные растения невозможно регенерировать из онкогенных клеток корончатых галлов, большинство современных векторов на основе Ti-плазмид неонкогенны. Как упоминалось выше, главная особенность онкогенных систем трансформации с помощью агробактерий состоит в том, что галлы и косматые корни вырастают из эксплантатов, и, следовательно, трансформированные клетки легко отличить. Это очень важное свойство, поскольку трансформация эксплантатов с помощью неонкогенных векторов часто не позволяет отобрать резистентные к антибиотику ткани на фоне нетрансформированных клеток. Таким образом, онкогенные векторы, которые к тому же несут гены устойчивости к антибиотикам [38, 39], очень полезны для быстрого подбора наилучших эксплантатов и методик инокуляции, чтобы получить оптимальную трансформацию. Индукция микроопухолей в местах поранения с большой площадью поверхности, таких, как срезы клубня или главного корня (рис. 2.7), тоже представляет собой удобный способ получения. нескольких тысяч легко отличимых, независимых трансформантов. [c.109]

Трансформация протопластов изолированной ДНК. Впервые достоверная возможность химической трансформации растений бьша показана в опытах с двудольными. Их протопласты обрабатывали в присутствии полиэтиленгликоля вьщеленными Ti-плазмидами. После регенерации стенки клетки Tajin опухолевыми, а ДНК обнаружилась в ядрах, причем Т-ДНК оставалась в составе Ti-плазмид (Krens et ai, 1982). Этот результат позволил приступить к созданию векторов, предназначенных для переноса генов в растения без использования агробактерий. [c.382]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология