Трансформация растений с помощью агробактерий

ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ АГРОБАКТЕРИЙ [c.51]

Для трансформации растений с помощью агробактерий необходимо вьшолнение трех условий [c.53]

Для первоначального изучения чужеродной ДНК, встроенной в геном растения путем трансформации с помощью агробактерий, лучше всего использовать блоттинг-гибридизацию по Саузерну, как описано в гл. 5. Таким образом можно получить следующие данные [c.311]

Поскольку физиологически и морфологически нормальные растения невозможно регенерировать из онкогенных клеток корончатых галлов, большинство современных векторов на основе Ti-плазмид неонкогенны. Как упоминалось выше, главная особенность онкогенных систем трансформации с помощью агробактерий состоит в том, что галлы и косматые корни вырастают из эксплантатов, и, следовательно, трансформированные клетки легко отличить. Это очень важное свойство, поскольку трансформация эксплантатов с помощью неонкогенных векторов часто не позволяет отобрать резистентные к антибиотику ткани на фоне нетрансформированных клеток. Таким образом, онкогенные векторы, которые к тому же несут гены устойчивости к антибиотикам [38, 39], очень полезны для быстрого подбора наилучших эксплантатов и методик инокуляции, чтобы получить оптимальную трансформацию. Индукция микроопухолей в местах поранения с большой площадью поверхности, таких, как срезы клубня или главного корня (рис. 2.7), тоже представляет собой удобный способ получения. нескольких тысяч легко отличимых, независимых трансформантов. [c.109]

Основной недостаток системы агробактерий — это неспособность трансформировать злаковые, группу, к которой относится-большинство растений, употребляемых в пищу. Причина подобного ограничения круга хозяев в настоящее время не понятна она, возможно, заключается в отсутствии участков узнаванияг для бактерий на поверхности растительной клетки или в неспособности одного или более продуктов OiV-генов правильно функционировать в клетках однодольных. Однако следует отметить, что проблема круга хозяев не ограничивается только-однодольными. В самом деле, для многих культурных видо двудольных до сих пор не разработаны эффективные системы трансформации с помощью агробактерий (приложение 2[VIII]). Ткани-мишени некоторых видов растений, возможно, не в состоянии противостоять инфекции агробактериями либо чувствительны к бактерицидным соединениям ,- и это препятствует-трансформации. [c.194]

Трансформация через стадию каллуса будет описана на примере проростков льна [10], однако с помощью сходной методики были трансформированы и другие виды (приложение 2[УП1]). В предварительных экспериментах на растениях льна комбинация эксплантатов гипокотиля размером 1—2 мм, вырезанных из стерильных проростков двухдневного возраста, давала наиболее воспроизводимую индукцию каллуса и регенерацию на среде М804Х2. К сожалению, при всех комбинациях эксплантатов и среды большинство побегов возникает путем прямого формирования зародышей в глубоких клеточных слоях ткани исходного эксплантата. В этом заключена основная трудность, поскольку такие клетки не чувствительны к трансформации агробактериями. Однако часто бывает так, что образовавшийся на эксплантатах каллус, в котором происходит развитие большого числа зачатков побегов, тоже способен к регенерации, особенно если он еще прикреплен к первоначальному эксплантату. Такой каллус, предварительно заложенный благодаря росту в местах поранения на регенерирующих эксплантатах, может продолжать регенерировать после срезания и переноса на свежую среду для регенерации по крайней мере в продолжение одного или двух пассажей. Способность такого каллуса регенерировать в селективных условиях после удаления из ткани первоначального эксплантата сильно уменьшает вероятность того, что какие-либо регенерирующие побеги могут возникнуть путем непосредственного формирования зародыша без дедифференциации клеток, [c.131]

В процессе образования корончатого галла агробактерии способны трансформировать клетки, прилежащие к поврежденной ткани, которые претерпевают клеточные деления в ответ на поранение. Клетки интактного растения, как правило, проявляют максимальный онкогенный ответ на инфекцию А. tumefa iens между 1,5 и 3 днями после поранения. У различных видов эта компетентная фаза совпадает с первыми клеточными делениями в ответ на поранение. Как было показано [50], раневой ответ можно имитировать в культуре тканей, если превратить покоящиеся мезофильные клетки листа или активно делящиеся клетки суспензионной культуры в протопласты и индуцировать регенерацию клеточной стенки и клеточное деление в соответствующей среде. В определенной фазе становления культуры протопластов клетки компетентны для трансформации Л. tumefa iens. Технология совместного культивирования предусматривает инкубацию протопластов в присутствии агробактерий в соответствующей жидкой питательной среде и позволяет получать большое число трансформантов в контролируемых условиях, Варьируя условия культивирования, плотность высева и изменяя процедуру селекции, можно получить трансформированные колонии клонального происхождения. Важно иметь в виду, что корончатые галлы — это смесь нетрансформированных и различных типов независимо трансформированных клеток и, следовательно, фенотип галла представляет собой сумму фенотипов всех клеток, обнаруживаемых в опухоли. Однако клеточная популяция трансформантов, полученных с помощью сов- [c.151]

Трансформация протопластов ОМОТ-векторами с помощью какого-либо из методов, перечисленных в разд. 3.1.2, может быть предпринята по отношению к любому виду растений, для которого разработана система протопластов. Однако даже в этом случае, если жизнеспособные протопласты, способные к формированию клеточной стенки и делению, можно получить в достаточных количествах, у многих культурных видов такие клетки не являются тотипотентными. Таким образом, кроме работ по временной экспрессии, трансформация протопластов с помощью ВМОТ-векторов в действительности не вышла за пределы круга видов, чувствительных к агробактериям. Кроме того, существуют и значительные основания предполагать, что прохождение клеток через стадию недифференцированной культуры тканей тоже способно привести к изменениям генотипа растения. По этим двум причинам многие лаборатории в настоящее время разрабатывают методы трансформации, которые не нарушают нормальное развитие и клеточный цикл растения. [c.201]

Проблема введения в растительную клетку чужеродной ДНК также в принципе решена. Используются два основных подхода. Первый из них агробактериальная трансформация. Это слегка модифицированный естественный процесс горизонтального (то есть между отдаленными в систематическом отношении группами организмов) переноса генов от бактерий в растения. В природе существует большая группа почвенных бактерий из pojidi Agroba terium. Они могут вызывать у растений болезни типа рака — корончатый галл (опухоль) или бородатые корни . Выяснено, что с помощью специального механизма бактерии передают в генетический материал растений небольшой фрагмент своей ДНК, содержащий гены, активность которых приводит к образованию у растений опухоли или многочисленных корней. В них синтезируются вещества — опины, являющиеся питательным субстратом исключительно для агробактерий. Ученые просто вырезали из переносимого фрагмента ДНК бактериальные гены, вызывающие болезнь, и заменили их нужными им генами с соответствующими регуляторными элементами. Агро- [c.27]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология