Бинарные векторы

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Т1-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспечивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, содержащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется. [c.147]

Таблица L2, Примеры бинарных векторов (гра с-действующие Uir-гены)

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

Транс- или бинарные векторы конструируются на основе плазмид, содержащих последовательности границ Т-ДНК и способных реплицироваться как в Е. соН, так и в агробактериях (рис. 1.3, Б). Эти векторы могут быть устроены таким образом, чтобы последовательности границ фланкировали множественные [c.23]

Случайная регенерация Кт -побегов из клеток,содержащих Т-ДНК бинарного вектора, но не содержащих онкогенную Т-ДНК [c.104]

Из трансформированных клеток, содержащих Т-ДНК бинарного вектора, но утративших онкогенную Т-ДНК -плазмиды, случайно регенерируют Кт Побеги с нормальной морфологией [c.104]

Прямое образование побегов — около четырех Кт -побегов на 35% эксплантатов. Два типа побегов 1) аномальные тератомы с онкогенной Т-ДНК и Т-ДНК бинарного вектора, 2) нормальные побеги с Т-ДНК только бинарного вектора. [c.184]

Рассмотрим методику построения математической модели персептрона. В рецепторном поле образуется сигнал, соответствующий внешнему раздражителю, который описывается некоторым вектором д . Разработчик полагал, что каждое нервное окончание передает достаточно простой сигнал — либо посылает импульс, либо не посылает его. Это означает, что вектор л — бинарный, т. е. его координаты могут принимать только два значения О и 1. Система импульсов (так называемый пакет) распространяется до тех пор, пока с помощью нейронов второго слоя не будет преобразована в новый пакет импульсов. При этом бинарный вектор д преобразуется в бинарный вектор у. Преобразование у =/(л) имеет следующие особенности а) осуществляется пороговыми элементами б) входы преобразующих пороговых элементов соединяются с рецепторами случайно. [c.92]

Промежуточный и бинарный векторы. Эти векторы конструируются на основе Ti-плазмид. Промежуточный вектор получают путем ряда сложных операций. Сначала Т-область с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды, вставляют в вектор для клонирования в клетке Е. oli и размножают. Затем внутрь Т-области встраивают чужеродный ген и вновь размножают. Полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки А. tumefa iens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками Т-область рекомбинантной плазмиды, содержащая чужеродный ген, включается в Ti-плазмиду клетки хозяина, заместив в ней нормальную Т-область. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенньпли генами, заражают растения, где эти гены встраиваются в геном растительной клетки. [c.147]

Часто сельскохозяйственные культуры бывают подвержены нескольким вирусным инфекциям любая из них может нанести ущерб растениям и снизить урожай. В идеале трансгенные растения должны быть устойчивы более чем к одному вирусу. Чтобы достичь этой цели, для трансформации растений желтой яйцевидной тыквы ( u urbita реро) использовали бинарные векторы на основе Ti-плазмид, несущие один или несколько генов белков оболочки uMV, вируса желтой мозаики кабачков и вируса 2 мозаики арбуза (рис. 18.8). Трансгенные растения, в которых экспрессировались все три гена, в лабораторных условиях были устойчивы ко всем указанным вирусам. Растения, экспрессирующие гены белков оболочки вируса желтой мозаики кабачков и вируса 2 мозаики арбуза, были проверены в полевых условиях на устойчивость к тлям - насекомым, являющимся природным переносчиком этих вирусов в растущие растения. Если в растении экспрессировались оба гена белков оболочки, то они проявляли полную устойчивость к одновременной инфекции этими вирусами (рис. 18.9), а если наблюдалась экспрессия только одного из вирусных белков оболочки, то заражение происходило не сразу. [c.398]

Выделенную кДНК РАР вводили в геном табака и картофеля с помощью бинарных векторов на основе Ti-плазмид. Трансформанты, синтезирующие РАР в большом количестве (> 10 нг на [c.400]

Смысловые и антисмысловые конструкции, находящиеся под контролем 358-промотора вируса мозаики цветной капусты, были встроены в бинарный вектор на основе Ti-плазмид и введены в клетки растений. У трех из 133 смысловых трансформантов и трех из 83 антисмысловых цветки были белыми, что указывало на подавление экспрессии эндогенного гена халконсинтазы, [c.406]

Примеры векторных систем, имеющих трАнс-действующие игг-гены, представлены в табл. 1.2. Эти бинарные векторы варьируют по размерам, стабильности репликации в агробактериях, наличию рестрикционных сайтов для встраивания чужеродной ДНК, возможности использования X-GAL для скрининга рекомбинантных плазмид путем а-комплементации, наличию маркерных генов для селекции трансформированных растений и селекции трансконъюгантов. Известно, что большинство этих плазмид совместимо с различными игг-плазмидами-помощниками А. tumefa iens, а многие совместимы и с Ri-плaзмидaмlи. [c.26]

Часто в агробактериях обнаруживается несколько копий бинарных векторов, тогда как векторы цис-тниа обычно присут- [c.30]

Недавно было показано, что из растительных тканей можно регенерировать нормальные трансформированные побеги, утратившие онкогены Т-ДНК, если для обеспечения хелперных vir-функций использовать штаммы А. tumefa iens [20] и А. rhizogenes [46, 53] дикого типа в сочетании с неонкогенными бинарными векторами, несущими доминантные маркерные гены. Из [c.31]

Основные методы рекомбинантных ДНК, необходимые для инсерции генов -в трансформирующие векторы растений, не отличаются от таковых, используемых в работе с малыми плазмидами любого другого типа, реплицирующимися в Е. соИ. Рестрикционный фрагмент ДНК, несущий нужный ген, с помощью ли-гирования встраивают либо в промежуточный вектор (используемый для образования коинтегранта с Ti-плазмидным вектором г йс-типа), либо в бинарный вектор, а затем трансформируют подходящий хозяйский штамм Е. соИ с помощью стандартных методик. [c.35]

Выделение малых плазмид в больших количествах из . o/i — это важный этап любой серии манипуляций, имеющей целью встраивание генов в трансформирующие векторы растений. Плазмиды могут содержать ген, предназначенный для переноса, в специфичном рестрикционном фрагменте или могут быть частью векторной системы трансформации растений, например промежуточным вектором для коинтеграции с модифицированной плазмидой или бинарным вектором, способным реплицироваться в Е. oli и агробактериях. [c.42]

JOT две системы конъюгации — первая для промежуточных векторов на основе репликона olEI, используемых в сочетании с векторами коинтегративиого типа, и вторая для репликона rK2, на основе которого сконструированы многие бинарные векторы. Для обеспечения функций мобилизации (mob) и переноса ira), действующих в транс-положении, используют плазмиды-помощники конъюгации ( хелперные плазмиды), специфичные для репликонов обоих типов, либо на отдельных реп-ликонах, либо интегрированные с хромосомой в специальных хозяйских штаммах агробактерий [36]. Для того чтобы система конъюгации функционировала, клонирующие векторы должны содержать специфичное начало переноса ( ориджин — опТ) и сайт активации bom), на которые действуют продукты генов tra и mob. [c.73]

В дополнение к этим наблюдениям показано, что два не-сцепленных сегмента Т-ДНК, присутствующие в одной и. той же трансформированной клетке, сегрегируют в Fi-поколении [22, 60]. Таким образом, если даже большинство морфологически аномальных растений, регенерированных из к льтуры косматого корня или опухолей побегового типа, содержат он-когенную Т-ДНК при условии, что неонкогенная Т-ДНК не присутствует в той же хромосоме, что и Т-ДНК бинарного вектора, [c.102]

Рнс. 2.5. Стратегии трансформации растений бинарными векторами совместно с онкогенными и иеоикогенными [c.104]

А. rhizogenes, поскольку у некоторых видов можно регенерировать трансформированные побеги из культивируемых косматых корней [77, 55, 57, 46, 69J. Точно так же оказалось возможным регенерировать трансформированные побеги внешне нор- мального вида из некоторых полуонкогенных корончатых галлов, индуцированных агробактериями, несущими побеговые мутанты Ti-плазмид [23], а также в некоторых случаях из корончатых галлов дикого типа, когда индуцирующий штамм агробактерий секретировал большое количество цитокининов [27]. Как подчеркивалось в общем введении к данной главе (разд. 2.1.3,4), в последнее время в различных источниках описана регенерация неонкогенных, устойчивых к антибиотику побегов из опухолей, при индукции которых в качестве oir-помощ-ника для бинарного вектора использовали онкогенные Т - или Ri-плазмиды дикого типа, хотя пока не ясно, насколько широко будет распространено это явление. [c.109]

В другом случае может оказаться более целесообразным перенести бинарные векторы с помощью конъюгации в штамм агробактерий, проявляющий повышенную вирулентность в отношении интересующих исследователя эксплантатов, а затем попытаться регенерировать резистентные к антибиотику побеги из трансформированных, неонкогенных клеток, присутствующих в опухолевой ткани. [c.114]

Для разработки методов получения неопластических, резистентных к какому-либо антибиотику каллусов на безгормо-нальной среде в качестве помощников используют онкогенные угг-плазмиды с бинарными векторами, содержащими доминантный ген устойчивости к антибиотику . Это позволяет определить условия, оптимальные для трансформации. [c.116]

LBA4404(pBin 19) — штамм с бинарным вектором, содержащим селективный маркерный ген nos-npt-II, неонкогенной плазмидой и Uir-ПОМОЩНИКОМ. [c.121]

У 20% растений обнаружена только Т-ДНК бинарного вектора и не обнаружена онкогеиная Т-ДНК Ri-плазмиды. [c.186]

Фрагменты, гомологичные как правому, так и левому концу Т-ДНК. Такие фрагменты, вероятно, образуются вследствие тандемных вставок (Т), которые, как полагают, возникают в-результате предшествующей встраиванию конкатемеризации Т-ДНК. Вместе с тем составные фрагменты могут образоваться при встраивании отдельных фрагментов Т-ДНК очень близко друг к другу и в одной и той же ориентации либо возникают в результате амплификации после встраивания. Тандемные вставки чаще образуются при использовании бинарных векторов. Перевернутые тандемные вставки также образуют составные [c.314]

Следует принять некоторые меры для ограничения количества ДНК агробактерий, наносимого на гель, чтобы получившийся в итоге фильтр не оказался слишком неуравновешенным в отношении интенсивности конечного радиоактивного сигнала. Эта проблема возникает вследствие большого различия в размерах генома бактерии и растения. Поскольку известно, что Ti-плазмиды обнаруживаются в количестве 1—2 конин на бактериальную клетку, следует наносить такое количество агробактерий, которое было бы эквивалентно 1—5 геномам растения. К сожалению, это количество труднее подбирать для бинарных векторов в связи с тем, что их копийность в бактериальной клетке варьирует. В случаях когда копийность неизвестна, следует предварительно провести пробный блот-тннг, чтобы определить, какое количество ДНК следует наносить. [c.324]

Смотреть страницы где упоминается термин Бинарные векторы: [c.155] [c.393] [c.408] [c.413] [c.352] [c.19] [c.24] [c.25] [c.25] [c.27] [c.27] [c.30] [c.30] [c.31] [c.32] [c.35] [c.73] [c.76] [c.102] [c.111] [c.117] [c.185] [c.195] [c.200]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология