Электрофорез в оптимизирующий

Подготовительные эксперименты перпендикулярно-градиентный и оптимизирующий электрофорезы [c.159]

Независимо от того, бывает замедление резким или оно происходит плавно, один из двух результатов, полученных прн помощи оптимизирующих гелей, можно использовать для определения оптимальной продолжительности электрофореза. [c.164]

Рис. 9. Гели для оптимизации продолжительности электрофореза (оптимизирующие гели). На каждом рисунке показаны результаты, полученные в параллельно-градиентных денатурирующих гелях с нанесением образцов через определенные промежутки времени. Такие оптимизирующие гели дают представление об оптимальной продолжительности электрофореза, проводимого с целью максимального разделения мутантного фрагмента ДНК и фрагмента ДНК дикого типа. А. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, не претерпевшим заметных изменений подвижности по достижении участка с концентрацией денатурирующего вещества, соответствующей температуре плавления первого домена. Расстояние между вершиной и основанием геля измерено линейкой. Полученная информация используется для определения участка геля, соответствующего Гт первого домена плавления. Это значение в свою очередь было предварительно установлено в перпендикулярно-градиентном электрофорезе. Промежуток времени, за который фрагмент достигнет данного участка, считается минимальной продолжительностью проведения последующих электрофорезов. Обычно для получения оптимальных результатов к этому времени прибавляют еще 1—2 ч. Б. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, резко изменившим подвижность при плавлении первого домена. Электрофорез в течение 12 ч (лунка 1), 10 ч (лунка 2), 8 ч (лунка 3), 6 ч (лунка 4), 4 ч (лунка 5) и 2 ч (лунка 6). Через восемь часов прохождения через гель, когда начинается процесс плавления, фрагмент замедляет движение. Оптимальное время для последующих электрофорезов этого фрагмента — 9— 10 ч. В. Оптимизирующий гель с мутантными фрагментами и фрагментами дикого типа. Если имеется известный мутантный фрагмент, то гели такого типа можно использовать для эмпирического определения оптимального времени электрофореза. Это время, за которое достигается максимальное разделение утан иого фрагмента и рагмента дикого типа.

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Для определения оптимального времени электрофореза можно поставить простой эксперимент с оптимизирующим гелем. Аликвоты клонированного фрагмента тестируемой ДНК, вы-щепленного рестриктазами из вектора, наносят на параллельноградиентный гель с интервалом в 1 ч. Проводят электрофорез и затем окрашивают гель бромидом этидия, как было описано выше. Фотографируя гель с линейкой-маркером, расположенной сбоку, мол<но установить, в результате какого из нанесений (по времени) фрагмент ДНК оказался в зоне геля с концентрацией денатурирующего вещества, соответствующей Гт его первого домена плавления (рис. 9,Л). [c.164]

В работе [45] описан другой метод десорбции связавшегося материала с матрицы с использованием изоэлектрического фокусирования. Аффинный гель помещается в предварительно фокусированный градиент pH, который получают электрофорезом плоского слоя амфолитсодержащего геля. Система работает при низкой силе тока и высоком напряжении. Хотя ни этот метод, ни электрофоретическая десорбция по существу не были оптимизированы, оба метода открывают возможность проводить десорбцию в мягких условиях даже в случае систем с высоким сродством, таких, как биотин — авидин и антиген — антитело. [c.121]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология