Гель-электрофорез ПААГ

ПААГ-электрофорез - полиакриламидный гель-электрофорез [c.111]

Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются, современные методы электрофореза. В качестве носителей жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только он и будет подробно описан. [c.6]

Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделяют с помощью электрофореза в гелях (агарозном, полиакриламидном — ПААГ), из которых их экстрагируют, вырезая соответствующие участки геля, эти участки геля, например агарозного, расплавляют в пробирках при 68°С и ДНК экстрагируют фенолом, затем концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов При не- [c.192]

Проведите электрофорез надосадочных фракций и осадков в ПААГ [17], нанося на гель 50—150 мкг белка. [c.102]

Проанализируйте фракции, собранные при гель-фильтрации методом ДСН-электрофореза в ПААГ [ 7] и отберите фракции, содержащие гибридный белок (примерно 160 мг). [c.111]

ДСН-электрофорез в ПААГ в присутствии и в отсутствие 2-меркаптоэтанола с последующей окраской гелей. [c.121]

Каждому варианту свойственны собственные преимущества и недостатки. Общие принципы и методика эксперимента электрофореза в ПААГ подробно рассмотрены в ряде исчерпывающих публикаций [3, 35, 73, 183]. В ступенчатой системе образцы предварительно концентрируются в формирующем геле, после чего входят в рабочий гель в виде узких зон. В непрерывной системе предварительное концентрирование исключено и при нанесении образца в большом объеме по завершении электрофореза образуются широкие зоны. Если образец наносить в небольшом объеме, результаты в обеих системах должны быть идентичны. Наблюдающиеся иногда различия в результатах, возможно, обусловлены частичной диссоциацией комплекса при электрофорезе в ступенчатой системе. [c.27]

Электрофорез в ПААГ — ДСН, Продукты реакции исследуют с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН (разд. 1.3.1.1) или с помощью гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в присутствии денатурирующих агентов. Поскольку, по всей вероятности, поперечно-сшитые продукты будут иметь 100 ООО, готовят 5%-ный гель, а образец наносят в количестве 50 мкг. В случае простых олигомеров, содержащих идентичные или почти идентичные мономеры, состав определяют по количеству основных зон. Если степень сшивки невелика, молекулярные массы гибридных молекул, кратные молекулярной массе мономера, можно найти по градуировочному графику. Высокое содержание поперечных связей может быть причиной аномального поведения полимеров при электрофорезе. [c.56]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Активность GUS можно выявить in situ среди фракционированных белков после денатурирующего гель-электрофореза экстрактов. Такой подход помогает изучать белки, образующиеся в результате трансляционного слияния, а также посттрансля-ционный процессинг белков, например отщепление транзитных пептидов после переноса продукта химерного гена ab-GUS в хлоропласты. Аналогичный анализ химерного гена РБФК M -npt-II описан в разд. 6.7, в котором и приведены более подробные детали приготовления и проведения электрофореза в ПААГ. [c.371]

Ход работы. Приготовление геля. Электрофорез проводят на 5 % ПААГ, который готовят следующим образом. Берут 12,0 мл раствора, содержащего 8 % акрил-амида и 0,2 % бисакриламида. Чтобы вызвать полимеризацию в этом растворе добавляют 0,12 мл 10 %-го персульфата аммония и 0,12 мл 10 %-го ТЭМЭД. Концентрация SDS в геле — 0,1 %. Затем смесь быстро наносят на пластинки. Прежде чем произойдет полимеризация, на акрил-амид осторожно наслаивают небольшой объем трис-глицинового (электродного) буфера. Г ель готов к использованию через 2 ч. [c.260]

Электрофорез в ПААГ нативного белка в градиенте пористости геля Электрофорез проводят в блоках полиакриламидного геля размером 110x100x1 мм (Anderson et al., 1972) (Рис. 16). [c.58]

Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом. [c.75]

Выделенный нами основной энцефалитогеппый белок при электрофорезе в ПААГ обладает выраженной подвижностью по направлению к катоду. В щелочной среде (pH 8.3) он движется одной зоной, в кислой (pH 2.3) — тремя (в 7.5%-м геле) или пятью (в 15%-м геле) полосами. Эти данные позволяют предполагать, что выделенный белок представлен смесью белков очень близкой молекулярной структуры. [c.25]

В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным щагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сщивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецнл-сульфат натрия или ДСН (8В8) (рис. 4-48). [c.215]

На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом слу чае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигри- [c.217]

Они выглядят как большие, преломляюш,ие свет агрегаты, часто расположенные на полюсах клетки. О накоплении нерастворимого белка в процессе наращивания клеточной массы можно судить по появлению таких включений, а также с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). [c.101]

В ранних стадиях исследования было обнаружено, что хотя бы один из двух белков Р ассоциирован с рибонуклеопротеидным комплексом вирионов [25, 58, 257, 259]. По мере совершенствования условий электрофореза в ПААГ стало ясно, что вирион содержит три дискретных белка Р [112, 133, 200], которые обозначили Р1, Р2, РЗ по порядку уменьшения их электрофоретической подвижности в ПААГ (выявленная м. м. 95 000—82 000). На основе анализа рекомбинантов штаммов A/PR/8/34 и А/НК/68 определили, что 1-й сегмент РНК кодирует белок РЗ, 2-й сегмент РНК — белок Р1 и 3-й сегмент РНК — белок Р2 [194, 217], но у штамма A/FPV/Rosto k/34 кодируемые назначения сегментов РНК отличались [242]. Поскольку обозначение Р1—РЗ, согласно номенклатуре, основано на подвижности в геле, а не на функция , белок Р2 одного штамма может быть функционально эквивалентен белку РЗ другого штамма [7]. [c.42]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Для определения молекулярной массы мономеров используют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии ДСН и гель-фильтрацию в классическом и современном (ВЭЖХ) вариантах. Предпочитают использовать электрофорез в ПААГ или ВЭЖХ, однако в настоящее время ВЭЖХ уступает электрофорезу по качеству разрешения близких по молекулярной массе белков (гл, 6). Белки, содержащие более 10% углеводов, рекомендуется хроматографировать на агарозных гелях, так как электрофорез может не дать точных результатов из-за различия в связывании ДСН с полипептидной цепью и полисахаридными фрагментами. Следует также напомнить, что мономер может включать несколько полипептид-ных цепей, связанных дисульфидными связями, поэтому определение молекулярной массы следует проводить как до, так и после восстановления 5—5-мостиков. [c.26]

При электрофорезе в градиентном геле полипептиды мигрируют до достижения зоны с определенной пористостью, препятствующей их дальнейшему продвижению. Если все комплексы полипептидов с ДСН имеют одинаковую форму, концентрацию ПААГ в этой зоне можно принять характеристической для данной молекулярной массы [97, 99, 101, 137]. Комплекс может частично разрушиться с потерей ДСН, в особенности в области, близкой к равновесному состоянию, однако это не влияет на конечный результат. Объем образца не влияет па ширину белковых зон, тем не менее наносить образец в большом объеме не рекомендуется. При электрофорезе в градиентном ПААГ формирование градиента с высокой воспроизводимостью может быть затруднительным. Однако для этих целей выпускаются преформированные гели высокого качества. [c.28]

Зоны, представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-ного геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике 1 сп()льзуют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами. [c.39]

Крупные пептиды и белки трижды диализуют в течение 12 ч против 0,15 М Na l, содержаш,его 0,1% ДСН, а затем трижды против 0,027о ДСН. Если белок был выделен методом электрофореза в ПААГ — ДСН, элюат центрифугируют при 20 000 об./мин в течение 20 мин для удаления частиц акриламидного геля. Примеси красителя кумасси не мешают секвенированию. Однако следует помнить, что равновесное распределение ДСН через диализную мембрану — процесс медленный и может потребовать нескольких дней. Таким образом, окончательная концентрация ДСН в образце зависит от продолжительности диализа. [c.76]

Ниже описываются три общепринятых метода разделения нептидов. Первый из них ПААГ — ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), обычно в одномерном варианте. Разрешение пептидных фрагментов достигается благодаря различиям в их относительных подвижностях, не всегда отражающих истинные молекулярные массы. Очень важно, что электрофореграмму фрагментов одного белка можно сравнивать с электрофореграм- [c.223]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология