Очистка белков методом гель-хроматографии

Рис. 4-47. Типичные результаты, полученные при очистке белка различными методами хроматографии. В данном случае подлежащий фракционированию клеточный экстракт сначала пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой (А). Затем колонку промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим постепенно нарастающую концентрацию соли. Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле проходят через колонку не задерживаясь и собираются со дна колонки в первых порциях элюата. Остальные белки элюируются соответственно сродству к ионообменной смоле. Для элюирования белков, связывающихся со смолой наиболее сильно, требуется наивысшая концентрация соли. Исследуемый белок элюировался в виде узкого пика он был выявлен по ферментативной активности. Фракции с такой активностью собирали и наносили на вторую колонку для гель-фильтрации (Б). Фракцию все еще недостаточно очищенного белка выявляли по ферментативной активности активные фракции собирали и очищали до гомогенного состояния на колонке (В), содержащей иммобилизованный

Ж. Радиоактивно меченные фрагменты ДНК можно использовать пр выявлении сайт-специфических ДНК-связывающих белков мето дом торможения в геле, при очистке белков методом аффиннс хроматографии ДНК и при отборе бактерий, экспрессирующв определенный белок. [c.128]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

В последние 10 лет в нескольких лабораториях были разработаны методы получения высокоочищенной карбоангидразы из эритроцитов [34—42]. Они заключаются в осаждении гемоглобина смесью хлороформ—этанол [37, 39, 42] с последующей хроматографией на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой [34, 37, 42], ДЭАЭ-сефадексом [43] или гидроксилапатитом [37, 39, 42]. Белок хорошо переносит лиофилизацию, и в большинстве методов она используется на той или иной стадии выделения. Накопленный опыт препаративной работы выявил некоторые особенности методов очистки фермента. Обработка смесью хлороформ—этанол существенно не меняет большинство физико-химических свойств. Но, как показал рентгеноструктурный анализ, воздействие этой смеси на фермент С человека снижает качество кристаллов [22, 23]. Для удаления гемоглобина лучше использовать гель-фильтрацию [37] или хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе [43]. Качество кристаллов повышается, если проводится электрофоретическая очистка фермента [23] и если не применяется лиофилизация [22, 23]. [c.562]

В настоящее время для выделения сайт-специфических ДНК-связывающих белков разработаны гораздо более совершенные методы. Процедура обычно начинается с определения сдвига подвижности в геле. Благодаря этому можно выяснить, с каким именно участком на фрагменте ДНК связывается неизвестный белок в клеточном экстракте (см. рис. 9-9). Затем химическим способом синтезируется соответствующий этому связывающему участку двух цепочечный олигонуклеотид, который можно использовать двумя способами. При аффинной хроматографии олигонуклеотид связывают с нерастворимым пористым носителем, например агфозой, а затем таким нагруженным носителем заполняют колонку, которая селективно связывает белки, узнающие определенные последовательности ДНК. Этот относительно нетрудоемкий метод позволяет добиться 10000-кратной очистки. [c.103]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология