Ферменты выделение и очистка

В химической и нефтехимической промышленности эти методы могут использоваться для разделения углеводородов, смещения равновесия химических реакций путем удаления одного из ее продуктов, разделения азеотропных смесей, концентрирования растворов, очистки или отделения высокомолекулярных соединений из растворов, содержащих низкомолекулярные компоненты и т. п. в биологии и медицине — для выделения и очистки биологически активных веществ, вакцин, ферментов и т. п. в пищевой промышленности — для концентрирования фруктовых и овощных соков, молока и молочных продуктов, получения высококачественного сахара и т. п. [c.7]

Так как в процессе выделения фермента необходимо знать лишь относительную активность на отдельных стадиях очистки, то выражать ее можно в условных единицах (например, в единицах оптической плотности). Их выбор определяется методом измерения активности. После получения гомогенного или высокоочищенного препарата фермента его активность и удельная активность должны быть определены с использованием наиболее точных методов их измерения и выражены в международных единицах. Результаты очистки фермента суммируют в таблице [c.198]

При выделении фермента используют метод фракционирования белков путем изменения pH. Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение pH белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. Их вносят по каплям, по стенке сосуда, при постоянном перемешивании. После нейтрализации раствора проводят короткую инкубацию при 25—30° С, чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков. [c.199]

Большинство ферментов являются лабильными белками. При переводе их в экстракт они лишаются своего естественного (в клетке) окружения и легко подвергаются денатурации и инактивации под влиянием различных факторов. В связи с этим при выделении и очистке ферментов необходимо соблюдать целый ряд предосторожностей. Как правило, все операции следует проводить при 2—4° С (лучше — в холодной комнате), а фракционирование органическими растворителями — при температуре ниже О С. [c.196]

В биологии ионный обмен используют для разделения органических кислот, аминокислот и углеводов или выделения витаминов и антибиотиков, для очистки ферментов и других веществ. [c.142]

III. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ [c.216]

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА, СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ [c.117]

Каждый из двух указанных путей создания моделей ферментативных систем имеет свои преимущества и недостатки. Путь непосредственного исследования и воспроизведения механизма действия ферментов позволяет воспользоваться результатами длительного совершенствования природных катализаторов и раскрыть причины их высокой активности и специфичности. Однако этот путь сопряжен с большими трудностями по выделению, очистке, идентификации и анализу сложнейших органических молекул, составные части которых находятся в сложной взаимосвязи. Второй путь имеет то преимущество, что при постепенном усложнении простого катализатора можно изучить влияние отдельных факторов на его каталитическую активность. Следуя по этому пути, Николаев [76, 85—931 в своих многочисленных работах, посвященных созданию модельных катализаторов с каталазными и пероксидазными свойствами, пришел к интересным выводам относительно эволюции природных катализаторов этого типа. [c.262]

Существует обширная литература по выделению, очистке и использованию для структурных исследований ферментов, которые расщепляют почти все типы полисахаридов [72, 198]. [c.303]

У авторов была счастливая возможность одновременно решать фундаментальные и прикладные проблемы при изучении систем, включающих синтетические полимеры (особенно полиэлектролиты) и органические физиологически активные вещества (особенно ионы), а также принимать участие в выполнении научных и прикладных исследований по выделению, очистке и фракционированию антибиотиков, ферментов, гормонов, аминокислот, нуклеотидов и многих других групп органических веществ. [c.3]

Обнаружение, выделение, очистка и изучение свойств фермента зависят прежде всего от наличия достаточно точного и быстрого метода определения активности фермента, а также подходящего метода определения общего белка. Точное определение активности фермента на ранних стадиях очистки часто бывает сопряжено со значительными трудностями, поскольку посторонние ферменты, присутствующие в препарате, могут конкурентно действовать на субстрат. Например, в присутствии АТФ-азы затруднено определение АТФ-зависимых синтетаз, а присутствие р-амилазы мешает определению а-амилазы. Многих трудностей, связанных, например, с подавлением активности продуктами реакции, инактивацией фермента и изменением степени его насыщения субстратом, можно избежать, если измерять начальные скорости реакции. [c.98]

В последнее время получило достаточно широкое распространение применение иммобилизованных клеток микроорганизмов, содержащих естественный набор ферментов. Преимущества их по сравнению с иммобилизованными ферментами заключаются главным образом в том, что при использовании иммобилизованных клеток отпадают стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов, которые, как правило, являются наиболее дорогостоящими при осуществлении полного технологического процесса. Далее, ферменты в микроорганизме находятся в наиболее естественном окружении, что положительно сказывается на их термостабильности, а также так называемой операционной стабильности (продолжительности работы в условиях опыта). Известно много примеров, когда после выделения из организма ферменты быстро теряли активность, а иногда их вообще не удавалось выделить в активной форме, в составе же клеток микроорганизмов они сохраняли каталитические свойства достаточно долго. В этих случаях применение целых клеток, а не отдельных ферментов становится единственно приемлемым вариантом. Наконец, иммобилизованные клетки, как и иммобилизованные ферменты, представляют собой гетерогенные биокатализаторы со всеми преимуществами их использования в технологических целях. Иммобилизация клеток обычно проводится их адсорбцией на водонерастворимых носителях (часто на ионообменных смолах), ковалентной сшивкой с помощью бифункциональных реагентов (например, глутарового альдегида) или захвата их в полимер, как правило, с последующим формованием в виде частиц определенного размера и конфигурации. Иммобилизация целых клеток микроорганизмов предотвращает их размножение и обычно увеличивает сохранность и срок работы в качестве катализатора по сравнению с необработанными клетками. [c.12]

Теперь, когда мы располагаем свежим или оттаявшим материалом, можно приступить к гомогенизации и приготовлению экстракта, содержащего фермент в растворе. В большинстве случаев это первый этап очистки ферментов. Выделение субклеточных частиц или другого нерастворимого материала, которое проводят перед тем, как перевести фермент в раствор, кратко описано ниже (разд. 2.4). [c.39]

Ферментная технология включает продукцию, выделение, очистку, использование в растворенной форме и, наконец, применение в иммобилизованном виде ферментов в широком круге реакторных систем. Ферментная технология, вне всякого сомнения, обеспечит в будущем разрешение наиболее насущных проблем, стоящих перед обществом например, обеспечением пищей, источниками энергии (ее сохранением и использованием с максимальной эффективностью), а также улучшением окружающей среды. [c.77]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Иониты применяют в биологии для разделения органических кислот, аминокислот и углеводов, для выделения витаминов, алкалоидов и антибиотиков, для очистки ферментов и других веществ. Ионный обмен приобретает все большее значение в агропочвоведении и в агрохимическом анализе. А на промышленных предприятиях и электрических станциях иониты используют для умягчения или деминерализации воды. [c.302]

При выделении фермента на разных стадиях его очистки требуется интенсивное перемешивание раствора. Чтобы предотвратить сильное вспенивание и возможность денатурации фермента на поверхности раздела, используют различные типы мешалок. Целесообразно использовать мешалки с большими лопастями, что дает возможность, не снижая эффективности перемешивания, снизить скорость их вращения. Лопасти мешалки должны быть как можно глубже погружены в перемешиваемый раствор. При работе с небольшими объемами удобно использовать магнитные мешалки. [c.197]

Применение принципа иммобилизации не только к ферментам, но и к их субстратам, ингибиторам и кофакторам, т. е. в-вам, имеющим избирательное сродство к ферментам, позволило создать методы выделения и очистки послед)шх, основанные на аффинной хроматографии. Тем самым существенно расширяются возможности получения чистых ферментов для использования в И. э. [c.236]

Юкельсон Л. Я- Выделение фосфолипазы А и очистки некоторы.х других ферментов из яда среднеазиатской кобры. Автореф, канд, дисс., Ташкент, 1969. [c.236]

Обратная ситуация, когда лигандами служат ферменты, может встретиться при решении задачи выделения и очистки их субстратов и других компонентов ферментативной системы. Использование в качестве аффинных партнеров пары субстрат—фермент, разумеется, предполагает такие условия эксперимента, когда фермент не может осуществить каталитический акт преобразования субстрата, а только связывается с ним в комплекс, например в условиях отсутствия второго субстрата, необходимых ионов, прп неблагоприятном значении pH и т. д. [c.361]

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая удельная активность ). [c.198]

Орг. в-ва с помощью белка-переносчика попадают внутрь клеток микроорганизмов, где происходит окисление примесей, сопровождаемое выделением энергии и синтезом новых в-в с затратой энергии. Роль катализаторов превращений орг. примесей выполняют ферменты. Для разрушения сложной смеси орг. в-в необходимо 80-100 разл. ферментов. Микроорганизмы потребляют только растворенный в стоках кислород насыщение им воды осуществляют аэрацией. При очистке образуется избыток активного ила, к-рый утилизируют (см. ниже). [c.435]

Выделение и очистка фермента из скелетных мышц кролика [c.274]

В химической и нефтехимической промышленности мембранные методы применяют для разделения азеотропных смесей, очистки и концентрирования растворов, очистки или выделения высокомолекулярных соединений из растворов, содержащих низкомолекулярные компоненты, и т.п. в биотехнологии и медицинской промышленности-для выделения и очистки биологически активных веществ, вакцин, ферментов и т.п. в пищевой промышленности-для концентрирования фруктовых и овощных соков, молока, получения высококачественного сахара и т. п. Наиболее широкое применение мембранные процессы находят при обработке воды и водных растворов, очистке сточных вод. [c.313]

Примером применения аффинной хроматографии для очистки ферментов может служить выделение стафилококковой нуклеазы (фермен- [c.161]

Область применения коагулянты при очистке природных вод на станциях хозяйственно-питьевого водоснабжения, при выделении ферментов и антибиотиков применяются в производстве кинофотоматериалов при обезвоживании осадков. [c.272]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Такое параллельное развитие существенно способствовало созданию новой отрасли технологии — ферментной инженерии. Согласно Виньяру [48], последняя включает производство, выделение, очистку, иммобилизацию и использование ферментов в различного типа реакторах. Практическое использование ферментов стало возможным благодаря новейшим достижениям энзимологии, а именно после выяснения структур и механизмов действия ряда ферментов, имеются большие возможности для практического применения иммобилизованных ферментов в анализе, медицине и промышленности. Упрощение процесса выделения ферментов с помощью аффинной хроматографии, по-видимому, может привести к получению недорогих ферментов в требуемых количествах. [c.11]

Химический анализ природного соединения, как известно, включает в себя ряд общих процедур, таких, как экстракция, выделение, очистка и определение его химической структуры. Для извлечения неизвестных соединений обычно используют путь ступенчатой экстракции растворителями по мере возрастания их полярности петролейный эфир, бензол, серный эфир, этилацетат, спирты и вода. Преимуществом спиртовых экстракций перед водными является низкая точка кипения этих растворителей, однако в этом случае возможно расщепление эфирных связей, например эфиров фенолов с сахарами (Swain, 1965). Недостатки водной экстракции извлечение большого количества посторонних веществ, невозможность предотвращения действия всех ферментов, функцию которых не может устранить даже кипячение. Дифференцированный подход следует избирать и при выборе метода разделения веществ. Разделение на бумаге Ватман 3 ММ удобно применять в том случае, когда нужно получить до 0,5 г вещества, разделение на колонках — для выделения больших количеств вещества. Ниже приводится схема препаративного выделения, использовавшаяся для изолирования и идентификации природного ингибитора роста капусты (фенольное вещество, 12 мг из 500 г листьев), ивы (халконглюкозид, 75 мг из 1000 г листьев), гороха (кверцетин-гликозил-кумарат, 500 мг, п-кумаровая кислота, 10 мг) и кукурузы (л-кумаровая кислота, 4 мг из 250 г листьев). Из листьев гороха была выделена также кофейная кислота. [c.34]

Затем следует восстановление, дегидратация и дальнейшее восстановление до бутирил-КоА, который потом может присоединить другую молекулу аце-тил-КоА. Все эти реакции обратимы, и равновесие в них сдвинуто в сторону распада, а не синтеза. Вскоре был сделан вывод о необходимости изучения ферментных систем, хотя и способных синтезировать короткие цепи жирных кислот, но фактически предназначенных для разложения жирных кислот до ацетил-КоА. Однако у животных, растений и микроорганизмов были получены другие бесклеточные системы, которые синтезируют из ацетил-КоА высшие жирные кислоты (например, пальмитиновую). Интересная особенность этих систем состоит в том, что ожидаемые промежуточные соединения, такие, как сложные эфиры КоА жирных кислот с короткой цепью, не накапливаются. Установлено, что для синтеза необходим бикарбонат, хотя сам он в жирные кислоты не включается. Очистка ферментной системы, синтезирующей растворимые жирные кислоты, позволила обнаружить тот факт, что сложный полу-эфир малонил-КоА является промежуточным соединением и что он образован карбоксилирующей системой, представляющей собой фермент, содержащий биотин в качестве простетической группы. Основные особенности этой схемы приведены на рис. 10. Ацетил-КоА превращается в малонил-КоА, который потом включается в синтетазную систему. Таким образом, система, синтезирующая жирные кислоты, рассматривается как полиферментная система, характерной чертой которой является наличие активной SH-группы и связанного ФМН [31]. В ходе процесса малонат переносится к SH-группе фермента и конденсируется с ацетил-КоА, образуя ацетоацетильный фермент. Выделение [c.244]

Мураками и Эйлар [94] недавно описали очистку фермента, выделенного из придатка яичника овцы, который расщепляет 2-ацетамидо-1-(т.-р-аспарта-мидо)-1,2-дидезокси-р-в-глюкозу. Они использовали фракционирование сульфатом аммония и зонный электрофорез, в результате чего была достигнута 28-кратная очистка. Фермент был полностью отделен от N-aцeтил-P-D-глюкозаминидазы, которая встречается в той же ткани и от которой он отличается кривой зависимости активности от pH. Оптимум pH нового фермента 7,7. [c.297]

Эта глава знакомит читателя с основными методами н оборудованием, применяемым при очистке ферментов. Проводить очистку ферментов можно с помощью сравнительно простого оборудования к предметам первой необходимости относятся лишь центрифуги и УФ-спектрофотометр. Конечно, использова ние более сложного оборудования и автоматических систем зна чительно облегчает жизнь, но требует больших расходов В этой книге не раз будет подчеркиваться, что выделение фер ментов следует проводить без промедления. Любая процедура основанная на применении медленно функционирующего, нсна дежного или не всегда доступного оборудования, чревата опас остью потерять фермент. Используя только сравнительно про стые и обычные приборы, можно, как правило, работать без задержек. Мысль ясна — всегда следует сначала использовать самые простые приемы и только в случае неудачи прибегать к специальным методам. [c.10]

На основании полученных результатов разработан способ выделения и очистки протеазы. К.полученной описанным выше способом культуральной жидкости добавляли 2 объема охлажденного до -20°С ацетона (если объем культуральной жидкости больше 1-2 л, то ее лио-филизировали и затем растворяли в 0,5 - I л дистиллированной воды). Выпавший осадок центрифугировали 5 мин при 2000 g, промывали два раза ацетоном и высушивали на воздухе, йз осадка протеаза извлекалась экстракцией 0,01 М фосфатным буфером pH 8.Экстракты объединяли и лиофилизировали. Полученный сухой порошок представлял препарат протеолитического фермента грубой очистки (препарат I). Для избавления от примесей пигментов и других балластных веществ его растворяли в дистиллированной воде (1 г в 10 мл) и пропускали че- [c.71]

Термостабдльные ферменты имеют рлд преимуществ по сравнению с мезофильными, их активность при повышенной температуре (60-70 0, иногда и бодее) позволяет ускорить и модифицировать некоторые технологические процессы во многих отраслях пищевой и других вдцдх промышленности. Термостабидьные ферменты менее подвержены инактивации в процессах получения, выделения, очистки и хранения. [c.140]

Фермент гиалуронидаза (КФ 3.2.1.35) гидролизует р-1,4-глико-зидные связи между повторяющимися дисахаридными звеньями гиа-луроновой кислоты и является действующим веществом таких лекарственных препаратов, как лидаза и ронидаза. Целью нашей работы являлась разработка технологии очистки гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота с использованием сорбентных методов выделения. [c.96]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

Выделение и очистка ферментов, даже из доступного источника — работа весьма трудоемкая и требующая высокой квалификации, а изутсние их специфичности (знание которой, собственно, и обеспечивает столь высокую информативность ферментативного гидролиза) составляет сложную самостоятельную исследовательскую работу. Что же касается высоко очищенных ферментных препаратов, выпускаемых промышленностью, то многие из них исключительно дороги. [c.107]

Раздел Энзимология рассчитан на студентов, уже иознакомиз-" шихся с некоторыми современными методами химии белка определением концентрации белка, хроматографией, электрофорезом и др. Основная цель его состоит в том, чтобы дать возможность студентам приобрести навыки экспериментальной работы, необходимые для начинающего энзимолога. В ходе практикума студенты осваивают методы выделения и очистки какого-либо фермента, а также изучают свойства полученного препарата. В связи с этим приводятся общие указания по работе с ферментами, способам их очистки, правилам определения каталитической активности и кинетических свойств. Во второй части раздела описываются методы выделения ферментов из пекарских дрожжей и животных тканей (скелетных мышц, печени). Поскольку современные методы очистки ферментов включают большое разнообразие приемов, в ряде случаев для получения одного и того же фермента дается описание 2—3 методик, которые могут быть использованы в соответствии с уровнем оснащенности лаборатории. Кроме того, для ферментов из разных источников приводятся различные методы выделения. [c.196]

Тяжелый меромиозин элюируется с колонки одним пиком. Фракции этого пика диализуют в течение 1 ч против раствора с 5 мМ ЭДТА, затем в течение ночи против бидистиллированной воды (2—3 смены). Следует помнить, что все операции по выделению и очистке проводятся на холоде. Раствор фермента в бидистиллированной воде хранят в холодильнике и используют в течение 2—3 нед. [c.395]

Применеиие. Ж х важнейший физ -хим метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов белков ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых к-т, углеводов, липидов, гормонов и т д, изучения процессов метаболизма в живых организмах лек препаратов, диагностики в медицине, анализа продуктов хим и нефтехим синтеза попупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод, изучения изотерм сорбции из р-ра, кинетики и селективности хим [c.153]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология