Электрофоретические методы очистки ферментов

Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201]

На конечных стадиях очистки ферментов часто используется электрофорез. Это — физический метод, в основе которого лежит различная скорость движения отдельных белков в электрическом поле, определяемая величиной свободного заряда их молекул. Так как количественные соотношения положительно и отрицательно заряженных групп в белках неодинаковы, то различия в их свободном (суммарном) заряде могут служить основой для электрофоретического разделения белковых смесей. Когда белок находится в изоэлектрическом состоянии, т. е. его суммарный отрицательный заряд равен положительному, то в электрическом поле он неподвижен. При различных pH среды он может двигаться либо к аноду, либо к катоду, причем с неодинаковой скоростью. [c.154]

Другие методы, сгруппированные под общим названием электрофоретические методы , распространены не столь широко по причинам, которые будут рассмотрены в разд. 5.2 и 5.3. Третий, мало используемый прием разделения веществ в растворе— фазовое распределение, — при котором белки могут перемещаться из одной жидкой фазы в другую, описан в разд. 5.4. В качестве общего метода разделение веществ в растворе играет важную роль как в научных исследованиях, так и в промышленной очистке ферментов и других белков. [c.197]

Протеолитические ферменты катализируют ограниченное расщепление, в результате которого образуются с хорошим выходом относительно крупные фрагменты. Поскольку каждый пептид должен быть выделен в чистом виде, что обычно осуществляется с помощью хроматографических и электрофоретических методов (гл. 5), то чем меньше число фрагментов, тем проще проблема их очистки. [c.179]

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электрофоретическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование [c.127]

О гомогенности ферментов после их очистки судят на основании сопоставления результатов, полученных несколькими методами. К ним относятся ультрацентрифугирование, электрофорез и определение растворимости белка. Наиболее чувствительным способом исследования степени гомогенности ферментов и других белков является сочетание электрофоретического разделения с иммуноэлектрофорезом на агаре. [c.128]

В последние 10 лет в нескольких лабораториях были разработаны методы получения высокоочищенной карбоангидразы из эритроцитов [34—42]. Они заключаются в осаждении гемоглобина смесью хлороформ—этанол [37, 39, 42] с последующей хроматографией на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой [34, 37, 42], ДЭАЭ-сефадексом [43] или гидроксилапатитом [37, 39, 42]. Белок хорошо переносит лиофилизацию, и в большинстве методов она используется на той или иной стадии выделения. Накопленный опыт препаративной работы выявил некоторые особенности методов очистки фермента. Обработка смесью хлороформ—этанол существенно не меняет большинство физико-химических свойств. Но, как показал рентгеноструктурный анализ, воздействие этой смеси на фермент С человека снижает качество кристаллов [22, 23]. Для удаления гемоглобина лучше использовать гель-фильтрацию [37] или хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе [43]. Качество кристаллов повышается, если проводится электрофоретическая очистка фермента [23] и если не применяется лиофилизация [22, 23]. [c.562]

Поскольку здесь рассматриьаются общие химические черты ферментативного катализа, мы в большинстве случаев будем избегать подобных осложнений и ограничимся, где это возможно, только простейшим типом мономерного фермента. Белок этого типа — обычно большая молекула, состоящая из одной полипептидной цепи, содержащей, возможно, несколько сот аминокислот и свободно существующая в растворе внутри клетки. Такой белок можно очистить до степени гомогенности (по нескольким различным критериям), используя хроматографические и электрофоретические методы, пригодные для разделения заряженных макромолекул в водной среде [5]. На этой стадии очистки при благоприятных условиях белок можно закристаллизовать. Многие ферменты, таким образом, становятся доступными в качестве вполне определенных органических соединений, удовлетворяющих обычным критериям чистоты, и они, естественно, могут быть синтезированы 6]. Они также могут быть получены в значительных количествах, i e хорошо изученные ферменты — например, трипсин, химотрипсин, лизоцим и рибонуклеаза — доступны в граммовых количествах. Значительное число других доступны коммерчески в миллиграммовых количествах. [c.450]

GGT из почек мыши. Чувствительный электрофоретический метод разделения смеси GGT-антител позволяет продемонстрировать сильное иммуновзаимодействие между GGT из почек мыши и антителами против GGT из почек крысы. Это подтверждает возможность использования иммобилизованных антител против GGT из почек крысы в качестве иммуноадсорбента для очистки GGT из почек мыши. Данные по очистке фермента из почек мыши суммированы в табл. 7. Подробная методика во многом аналогична описанной выше общей методике. После повторной хроматографии активность GGT увеличивается в 530 раз при суммарном выходе 35%. [c.160]

Резюмируя рассмотрение количественных методов определения активности рестриктаз, следует отметить, что они являются адекватными приемами для изучения кинетических параметров катализируемых этими ферментами реакций. Несомненно, что в аналогичных опытах они найдут применение и в будущем. Однако, их использование в таких экспериментах, как, например, очистка рестриктаз и изучение влияния условий культивирования на содержание целевых предметов в биомассе, является малопривлекательным. Это, кроме отмеченных выше ограничений, выражающихся в необходимости подбора в каждом конкретном случае подходящих субстратов, обуслов-ленно трудоемкостью приготовления таких субстратов (это замечание особенно касается радиоактивных субстратов) и анализа продуктов реакции. На всех этих этапах необходимо располагать уникальной аппаратурой и возможностью работать с изотопами. Хотя часть из обсуждаемых методов и была использована в единичных опытах по очистке рестриктаз [106, 163, 184, 254,], по вышеизложенным причинам они распространения не получили. Их трудоемкость является очевидной, а выигриш в точности определения в таких опытах по сравнению с электрофоретическим методом не окупает затрат. [c.129]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология