Фракционирование клеток клеточного

Клеточные популяции можно анализировать биохимически, разрушая клетки и анализируя их содержимое с помощью ультрацентрифугирования. Дальнейшее фракционирование позволяет создать функциональные бесклеточные системы такие системы необходимы для определения молекулярных деталей сложных клеточных процессов. Например, с помощью этого метода в недавнее время были исследованы синтез белка, репликация ДНК, сплайсинг РНК и различные типы внутриклеточного транспорта. [c.220]

Большинство работ по изучению биосинтеза природных соединений проводилось на целых растениях и интактных микробных клетках. Такой подход обычно применим для ряда простых предшественников, которые легко преодолевают барьер клеточных стенок однако иногда, особенно в случае сложных предшественников, например олигопептидов, проницаемость клеточных мембран может стать серьезным ограничением. Даже если этот фактор ие стал лимитирующим, сложные промежуточные соединения внутри клетки могут подвергаться действию других ферментов, помимо ферментов, участвующих в исследуемом биосинтетическом пути. В этой связи понятно, что дальнейший прогресс в изучении биосинтеза невозможен без привлечения специальных биохимических методов, в особенности техники работы в бесклеточных системах и с фракционированными ферментами. В последние годы в этом направлении наметились определенные сдвиги [15]. [c.349]

Изучение клеточной организации и попытки установить связь между структурой и функцией на различных иерархических уровнях — от простых молекул до макромолекул и таких агрегатов, как мембраны или частицы, до субклеточных единиц и, наконец, клеток — все это составляет одну из самых увлекательных и перспективных областей исследования в современной биологии. Для биохимика и цитолога выяснение химического значения различных сложных структурных элементов, обнаруженных в клетке, важно не только само по себе оно является необходимой ступенью любого исследования, направленного на то, чтобы понять, как происходит синтез, распад и взаимодействие этих элементов. Мы начинаем догадываться, что именно в этих сложных структурах скрыт секрет механизмов, с помощью которых осуществляется регуляция клеточных процессов как в пространстве, так и во времени. Этот секрет, возможно, заключается, по крайней мере отчасти, в том, что различные клеточные компоненты — главным образом ферменты, а также их субстраты и модификаторы (активаторы и ингибиторы) — находятся в разных отсеках клетки и потому не всегда доступны друг для друга. Из сказанного вытекает два вывода, подтвержденных в последнее время многочисленными экспериментальными данными 1) в клетке существует четкое распределение некоторых ключевых компонентов, особенно ферментов они локализуются в (или на) определенных клеточных структурах, представляющих собой микроскопические внутриклеточные органы, так называемых органеллах 2) эти структуры, а вместе с ними и соответствующие клеточные компоненты можно выделить с помощью подходящих мягких методов разрушения клеток (гомогенизация) и последующего фракционирования. [c.239]

Для получения гранул в виде осадка, который можно подвергнуть анализу, производят фракционированное центрифугирование этих экстрактов, прибавив к ним предварительно раствор солей или сахарозы соответствующей концентрации и удельного веса. В результате непродолжительного центрифугирования при небольших скоростях из экстрактов удаляются оставшиеся целыми клетки, клеточные ядра и большие гранулы, называемые митохондриями. Дальнейшее центрифугирование при больших скоростях приводит к осаждению субмикроскопических гранул, называемых микросомами [97—100]. Для разделения цитоплазматических гранул можно применить также хроматографию [101]. [c.396]

Такой способ фракционирования можно сочетать с выделением пробы. Например, при исследовании липидных фракций одноклеточных организмов первой стадией является деструкция клетки, обычно выполняемая под давлением или с помощью ультразвука. В любом случае разрушаемые клетки помещают в метанольный или водный раствор. Раствор сильно подщелачивают (10%-ный раствор гидроксида натрия) и оставляют на ночь. На этой стадии большинство эфирных связей (триглицериды) гидролизуются, а свободные кислоты, конечно, полностью нейтрализуются сильным основанием. Экстракция таким неполярным растворителем, как -гептан, приводит к удалению только так называемых не омыляемых липидов (стеринов), не затрагивая заметную часть основы клеточного вещества. Большие массы остатков органического вещества клетки могут создавать затруднения при экстракции, особенно после гидролиза. Поэтому перед экстракцией удобно проводить чисто механическое разделение — удалять остатки органических веществ центрифугированием. Фракция, содержащая жирные кислоты, может быть получена подкислением водной фазы с последующей второй экстракцией гептаном. [c.516]

Биохимический анализ часто сопряжен с разрущением тонкой структуры клеток. Однако в настоящее время разработаны методы мягкого фракционирования клеточного содержимого, целью которых является сохранение функции различных клеточных компонентов. Подобно тому как ткань можно разделить на составляющие клетки различных типов, клетки можно разделить на ее функциональные органеллы и макромолекулы. В этом разделе мы сосредоточим внимание на методах, позволяющих проводить очистку органелл и белков Родственные методы мечения макромолекул радиоизотопами и антителами, равно как и чрезвычайно эффективные методы анализа ДНК и функции генов, обсуждаются в последующих разделах. [c.208]

Ниже мы очень кратко рассмотрим данные по анатомии клетки, полученные с помощью электронного микроскопа, и опишем соответствующие клеточные структуры затем мы обсудим методику фракционирования клеточных компонентов и некоторые свойства получаемых фракций и, наконец, попытаемся как-то оценить эти данные с точки зрения биохимии и энзимологии. [c.239]

При данной скорости вращения ротора время, требующееся для осаждения в центрифуге популяции гомогенных частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и первой степени разности между плотностями частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Таким образом, относительно гомогенные, приблизительно сферические частицы с примерно одинаковой плотностью могут быть отнесены к разным классам на основании одних только различий во времени, необходимом для их осаждения. Именно на этом и основана классическая схема фракционирования клеточных компонентов. Вначале удаляют целые клетки и крупные обломки клеток затем — фракцию, содержащую крупные и плотные ядра (плотность ДНК при 4° равна а плотность большинства белков — только 1,188) [c.249]

Хотя доступные в настоящее время препараты ДНК бактерий, животных и растений, несомненно, представляют собой многокомпонентные смеси, эффективного их фракционирования с помощью существующих методов добиться не удается. В отдельных случаях, однако, удается получить данные, указывающие на присутствие в суммарном препарате ДНК полинуклеотидов, отличающихся по своим свойствам от основной массы ДНК клеточного ядра и являющихся, таким образом, особыми разновидностями ДНК. Так, из препаратов ДНК бактерий при фракционировании с помощью противоточного распределения, центрифугирования в градиенте сахарозы, хроматографии на фосфате кальция или колонках с МАК получены фракции, свойства которых соответствуют свойствам одноцепочечной ДНК (см., например, предполагается, что такая ДНК является промежуточным продуктом при воспроизведении ДНК в клетке. [c.34]

Однако, как ни легко этот метод описать, его не так просто оказалось применить на деле. Дело в том, что, как показала практика, с ферментами нужно обращаться гораздо мягче, чем это позволяли методы, известные химикам-органикам на рубеже XIX и XX вв. Поэтому, прежде чем приступить к очистке и выделению ферментов, нужно было сначала разработать новые и очень мягкие методы фракционирования. Эти новые методы фракционирования заключались в следующем. Фермент осаждали из экстрактов, добавляя к водному раствору органические растворители или высокие концентрации солей использовали также обратимую адсорбцию содержащегося в экстракте фермента на ионных поверхностях различных твердых материалов, например силикагеля. Как бы то ни было, выделение из клеточного экстракта фермента в чистом виде представляло собой грандиозную задачу — ведь даже фермент, которого в клетке относительно много, редко составляет более 1%, а обычно всего лишь 0,1% всего органического материала клетки. До этого из биологических источников в достаточно чистом виде были получены лишь немногие органические соединения. Из-за этих трудностей фермент в чистом виде был впервые получен лишь в 1926 г. Джеймсом Самнером. Это была уреаза, катализирующая гидролиз мочевины с образованием аммиака и СО . [c.82]

Рибосомы вьщеляют путем дифференциального центрифугирования клеточного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно, что этим путем удается разделить клеточное содержимое на ряд фракций (см. гл. I). Рибосомы связаны главным образом с мембранами эндоплазматической сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осаждаются вместе с обломками липопротеиновой мембраны—микросомами. [c.285]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

При изучении рибосом и других компонентов клетки применяются разнообразные биохимические методы. Один из самых главных основан на фракционировании клеток. Основные этапы этой процедуры показаны на рис. 4.6. По своей идее она очень проста клетки размалываются и превращаются в суспензию в определенной среде, образуя нечто вроде супа, который затем переливают в пробирку и центрифугируют с возрастающей скоростью. Разные клеточные элементы образуют осадок, который затем подвергают биохимическому анализу. В нервных клетках [c.86]

Главной проблемой является индукция антител, специфических к индивидуальным молекулам клеточной поверхности. Если антитела индуцируются иммунизацией особей одного вида клетками или субклеточными фракциями другого вида, то иммунный ответ оказывается сложным и антисыворотка требует значительного фракционирования и очистки. [c.219]

Помимо химических средств, гипотермии и гипоксии модификация радиорезистентности производилась с помощью фракционированного облучения в невысоких летальных дозах. На клетках асцитной карциномы было показано, что при увеличении времени между двукратным облучением одновременно с возрастанием радиорезистентности объектов общее содержание эндогенных тиолов увеличивается. Параллельное исследование радиорезистентности и уровня сульфгидрильных групп проводилось также на клетках, находящихся на разных стадиях роста и клеточного цикла. Так, Э. Я. Граевский (1969) привел сравнительные данные из работ по изучению изменения тиолов и радиорезистентности микроспор в процессе клеточного деления. Оказалось, что в процессе мейоза и митоза происходят однонаправленные изменения содержания тиолов в клетках и их устойчивости (устойчивость оценивалась по выходу хромосомных аберраций) к действию ионизирующей радиации. Динамика изменения уровня эндогенных сульфгидрильных групп в зависимости от изменения радиорезистентности прослежена также на синхронно делящейся икре морских ежей в различных стадиях клеточного цикла, на растущих клетках асцитной карциномы Эрлиха в процессе ее старения, на синхронной культуре клеток разных штаммов хлореллы в процессе клеточного деления, на клетках в различных фазах роста. Эти данные позволили авторам заключить, что изменения радиочувствительности в цикле связаны не только с изменением генетического аппарата в клетке, но и с варьированием содержания внутриклеточных тиолов, выполняющих функции эндогенных радиопротекторов. Эти представления получили дополнительное обоснование в работе Ю. В. Корогодиной и др. (1975). Так, на диплоидных дрожжах (штамм Мегри 139 В) было установлено, что клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, в отличие от стационарной фазы более радиорезистентны и содержат в полтора раза больше сульфгидрильных групп. Авторы считают, что именно высокий уровень тиолов почкующихся дрожжевых клеток может определять их повышенную радиорезистентность. [c.283]

Фракционирование гомогенатов. Из гомогената можно выделить субклеточные частицы, как надмолекулярные (клеточные органеллы), так и отдельные соединения (ферменты и другие белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты) (см. рис. 6.8). Например, с помощью дифференциального центрифугирования можно получить фракции ядер, митохондрий, микросом (микросомы — это фрагменты эндоплазматического ретикулума). Эти органеллы различаются размерами и плотностью и поэтому осаждаются при разных скоростях центрифугирования. После осаждения микросом в надосадочной жидкости остаются растворимые компоненты клетки — растворимые белки, метаболиты. Каждую из этих фракций можно разными методами фракционировать дальше, выделяя составляющие их компоненты. Из выделенных компонентов можно реконструировать биохимические [c.195]

Фракционирование клеток в солевом растворе осложняется тенденцией гранул образовывать скопления и осаждаться в виде комков, а не в виде отдельных частиц. Это нежелательное явление можно предотвратить, измельчая клетки в 0,88 М растворе сахарозы, в котором митохондрии сохраняют палочковидное строение и способность к суправитальному окрашиванию янусом зеленым В. Однако при указанной концентрации сахарозы среда становится настолько вязкой и плотной, что для осаяедения субклеточных фракций приходится использовать чрезвычайно высокие скорости центрифугирования. Поэтому в современных исследованиях в качестве среды для измельчения клеток используют 0,25 М раствор сахарозы, в котором не происходит агрегации гранул и легко выделяется фракция митохондрий. Последние при этом обладают теми я е биохимическими свойствами, что и митохондрии, получаемые в 0,88 М растворе сахарозы, хотя они уяге не окрашиваются янусом зеленым В и имеют скорее шаровидную, а не удлиненную форму. При разделении путем дифференциального центрифугирования субклеточных фракций из гомогената в 0,25 М растворе сахарозы, полученного в гомогенизаторе Поттера — Эльвейема, удаление ядер и клеточных обломков, включая [c.130]

Способность кизельгура прочно сорбировать белки была использована В. С. Шапотом п сотрудниками, предложившими изящный метод фракционирования нуклеиновых кислот, входящих в состав клеточных нуклеонротеидов. Клетки гепатомы Зайделя, пометив предварительно в них РНК С- или Ш-уридином, а ДНК — Ш-ти-мпдпном, вскрывали детергентом, а гомогенат вносили на колонку, [c.245]

В последние годы проведен ряд работ по изучению процесса развития клеток в суспензиях. Показано, что клетки клена белого, развивающиеся в этих условиях, содержат водорастворимые полисахариды ГМЦ. После фракционирования с помощью ИОХ и ГПХ и очистки щелочью и а-(1—>-4)-эндополигалактуроназо выявлено присутствие в их составе ксилоглюкана, арабиноксилана и двух видов арабиногалактанов. Сделан вывод, что все нецеллюлозные полисахариды клеточных стенок клена белого присутствуют в составе водорастворимых полисахаридов, секретируемых клетками. [c.102]

Основные научные работы — в области биохимии нуклеиновых кислот. До 1964 занимался синтезом физиологически активных гетероциклических соединений пиримидинового ряда. Разработал твердофазный метод химического фракционирования транспортных рибонуклеиновых кислот на полиакрил-гидразидных сорбентах. Создал комплекс методов ультрамикро-биохимического анализа, позволяющий проводить исследование нуклеиновых кислот, белков и ферментов в масштабе отдельной клетки. Занимался изучением транспорта нуклеиновых кислот на модели гигантской одноклеточной водоросли — ацетобулярии и показал, что транспорт кислот не коррелирует с полярным ростом клетки (1973—1974), Осуществил сборку жизнеспособной клетки из отдельных компонентов — цитоплазмы, ядра и клеточной стенки, С 1974 занимается синтезом химических эквивалентов структурных генов белков и их встройкой а [c.613]

При разделении субклеточных компонентов мы сталкиваемся с двумя основными затруднениями. Первое из них связано с возможностью возникновения артефактов. В процессе разделения могут образоваться структуры, которых не было в исходной клетке. К артефактам относится, например, расщепление индивидуальных клеточных компонентов на субъединицы, утрата биологической активности субклеточными компонентами (в результате ферментативной шш иной деградации) в процессе выделения, неспецифическое связывание белков с нуклеиновыми кислотами и т. д. Хотя нет единого и притом надежного способа избежать артефактов, но в общеммы можем сказать, что при соблюдении определенных условий вероятность появления артефактов можно свести к минимуму. Условия эти следующие быстрота проведения всех операций по фракционированию, работа на холоду, применение наиболее мягких спо- [c.11]

Компримирование и осушка газа пиролиза. Этилен из газа пиролиза выделяют при низких температурах и высоких давлениях. Перед фракционированием газ компримируют. Осушка необходима потому, что газообразные углеводороды при низких температурах и высоком давлении образуют с водой гидраты — кристаллические комплексы типа СН4-6Н20 СгНе-ТИгО и т. д. Кристаллогидраты представляют собой клатратные соединения клеточной структуры. В данном случае клатратообразователем (КО) является вода соединение +КО клатрат (твердый). Молекулы клетки (воды) соединены между собой водородными связями, и заключенная в клетку молекула углеводорода не может вырваться . Кристаллогидраты затрудняют транспортирование газа, а при разделении газа пиролиза выпадение кристаллогидратов и льда может вызвать забивание аппаратуры и нарушение нормальной работы газофракционирующей установки. [c.40]

Название свободные полирибосомы не совсем точно отражает истинную ситуацию, так как на деле они не могут свободно диффундировать в цитоплазме, поскольку ассоциированы с клеточным цитоскелетом. Если клетки обработать неионным детергентом (тритоном) в гипертоническом буфере, то больщая часть липидов и растворимых белков удаляется, оставляя цитоске-летный каркас , связанный с остатками ядра. Этот каркас представляет собой сложное сплетение фибрилл. Все свободные полирибосомы ассоциированы с цитоскелетом, как это можно увидеть на электронной микрофотографии, приведенной на рис. 9.11, или определить при помощи биохимического фракционирования. [c.127]

Для исследования ультраструктуры клетки используют метод, основанный на гомогенизации ткани или разрушении клеточных стенок и последующем разделении субклеточных структур (фракционирование). После фракционирования клеток и последуюш его выделения ядра, митохондрий и микросом остается растворимая фракция (надосадок), состоящая из растворимых белков и ферментов гиалоплазмы. В ней основными являются ферменты, принимающие участие в процессах гликолиза [c.27]

Наконец, существует возможность перераспределения клеток по клеточному циклу. В гл. 8 отмечалось, что радиочувствительность клеток изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла. Предполагают, что при фракционировании дозы лредпочтительно будут погибать клетки, находящиеся в наиболее чувствительных фазах цикла. Разное перераспределение опухолевых клеток по сравнению с нормальными может привести к предпочтительной гибели клеток в опухоли. Однако многие ученые находят это положение сомнительным. [c.137]

Ионизирующее излучение может быть также использовано для лечения злокечественных опухолей. Радиационную гибель клеток и задержку деления клеток подробно рассматривали в гл. 3 и 4. К сожалению, гибель клеток опухоли не так проста, как представляют данные кривых выживаемости. Применение больших однократных доз облучения, способных инактивировать все опухолевые клетки, вызывает повреждение нормальных, окружающих опухоль, тканей. В результате многочисленных опытов радиологи пришли к выводу, что использование ежедневных более мелких фракций дозы является единственным путем излечения опухоли без существенного повреждения нормальных тканей. Эти режимы позволяют нормальным клеткам репарировать повреждения, однако репарация происходит как в нормальных, так-и в опухолевых тканях, поэтому обычное фракционирование дозы — не лучший способ лучевой терапии опухолей. И все же в настоящее время это, вероятно, единственный способ успешного лечения злoкaчe твeннь x новообразований облучением. Успех лучевой терапии рака зависит от ряда факторов, включающих радиочувствительность, репарацию, репопуляцию, реоксигенацию клеток и перераспределение клеток по клеточному циклу. [c.141]

Активированные митогеном клетки выделяют при фракционировании в градиентах фиколла, поскольку этот процесс обеспечивает удовлетворительный выход нужных клеточных форм и не требует много времени. Если в процессе прекультивирова-ния использовали антитела против IgM, иммобилизованные на сефарозе, то соответствующую суспензию, содержащую клетки и сефарозу, следует перед нанесением на градиент фиколла интенсивно пипетировать для того, чтобы освободить клетки, связавшиеся с гранулами сефарозы. После фракционирования сефарозу можно использовать повторно минимум для трех циклов стимуляции, если промыть ее стерильной дистиллированной водой и перевести в соответствующий буферный раствор. [c.238]

Поверхность клетки играет решающую роль в осуществлении определенных клеточных функций, включая иммунный ответ. Но, несмотря на это, наши знания о структурной организации биологических мембран и о механизме биохимических реакций, которые в них протекают, к сожалению, очень скудны. Для накопления информации в этой области мы должны прежде всего разделить мембраны на определенные субъединицы. При фракционировании мембранных белков и гликопротендов обычными биохимическими методами возникали трудности из-за того, что приходится одновременно очищать много разных белков, имеющих сходные молекулярные размеры или заряд. Применение моноспецифических сывороток для очистки антигенов клеточной поверхности помогает обойти эти препятствия, однако сложность получения таких сывороток ограничивает возможности их использования. [c.68]

Если инкубировать клетки без добавления актиномициша В, то в течение 100 с включение меченого уридина продолжается с начальной скоростью, а затем скорость включения снижается При фракционировании клеточного содержимого было показано, что более 95 % радиоактивности обнаруживается во фракции РНК. [c.51]

Процессы, характерные для целой клетки, протекают в отдельных клеточных частицах и органеллах, которые для анализа выделяют из клетки с помощью фракционирования. Этот процесс обычно состоит из двух этапов (разд. 1.10.3) сначала клетки разрушают, а затем из образовавшейся суспензии методом центрифугирования (гл. 2) выделяют нужные частицы и органеллы. Дальнейшее разделение индивидуальных компонентов клеточных частиц и органелл и изучение их свойств проводят с помощью центрифугирования (гл. 2), хроматографии (гл. 3) или электрофореза (гл. 4). Для. определения состава, механизма действия и функций клеточных компонентов пользуются сложными количественными и качественными аналитическими методами. На атомном и молекулярном уровнях применяют целый ряд спектральных методов (гл. 5) механизм действия клеточных частиц и внутриклеточные взаимодействия изучают, используя одновременно несколько аналитических методов, таких, как спектроскопия (гл. 5) и радиоизотопные методы (гл. 6), потенциометрия, полярография (гл. 7) и манометрия (гл. 8). [c.18]

Одиако до сих пор ии одна из попыток точно идентифицировать рецептор фитогормоиа не увенчалась успехом. В большинстве случаев исследователи пытаются выделить белковые рецепторы, используя при этом различные подходы. Чаще, всего применяют меченные изотопами фитогормоны с высокой удельной активностью. Один из методов заключается во введении радиоактивного гормона в растительные ткаии с их последующей гомогенизацией и фракционированием путем цеитрнфугироваиия или гель-фильтрации в надежде обнаружить радиоактивность только в определенной клеточной фракции. При использоваиии другого подхода радиоактивный гормон вносят в различные выделенные клеточные фракции, такие, как ядра, изолированный хроматин, фракции мембран, и измеряют сродсГво этих фракций к фитогормону по степени его связывания с ними. Кроме того, были сделаны попытки определить локализацию. меченых гормонов в клетках радиоавтографическими методами. Не вполне понятно, почему до сих пор не удалось выделить белковый рецептор ии для одного из фитогормонов. Следует сказать, что имеется ряд данных, предполагающих существование белковых рецепторов для цитокининов и гиббереллинов в растительных клетках, но наличие таких рецепторов еще не было подтверждено. [c.130]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология