Кленова ДНК-полимераза

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I 1 ед./мкл, кат. № 27-0928-01). [c.299]

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I 0,6 мкл. [c.300]

ДНК-полимераза I является прежде всего ферментом, репарирующим повреждения в структуре ДНК, и поэтому она с определенной частотой может исправлять синтетический олигонуклеотид-мутаген. В связи с этим в полимеразной реакции используют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, причем желательно брать фермент, полученный генно-инженер- [c.183]

Рис. 8.1. Олигонуклеотид-направленный мутагенез. Одноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь), несущую ген-мишень, отжигают с комплементарным синтетическим олигонуклеотидом, содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему основанию исходной ДНК. Олигонуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а М13-вектор с встроенным геном — матрицей. Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е. oli. Синтезированную полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза Т4. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют Е. соИ. Часть фаговых частиц содержит ДНК дикого типа, часть — мутантную ДНК.

Рис. 8.7. Внесение случайных мутаций в клонированный ген. Вектор, несущий клонированный ген, расщепляют рестриктазами RE1 и RE2, в результате чего образуются один 3 - и один 5 -укороченные концы (и соответственно один 3 - и один 5 -выступающие концы). Затем его обрабатывают ферментом ЕхоТП, который расщепляет ДНК только с укороченного 3 -конца, удаляя по одному нуклеотиду. Через некоторое время реакцию останавливают и заполняют образовавщийся пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. соИ. При этом в реакционную смесь добавляют все четыре дезоксинуклео-зидтрифосфата (dNTP) и в небольшом количестве -аналог одного из них. Обрабатывают продукт нуклеазой S1 для образования тупых концов, лигируют с помощью ДНК-лигазы Т4 и трансформируют клетки

Как уже упоминалось, чаще всего в качестве матрицы для анализа используются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах. Для унификации анализа последовательности любых фрагментов, клонированных в составе данного фага-вектора, можно использовать одну и ту же затравку. Для этого затравка должна быть комплементврна ие клонированному фрагменту, а (- -)-цепи фага вектора в том ее месте, которое граничит с З -концом клонированной вставки (рис. 185). В качестве затравок чаще всего используются синтетические олиго- и дезоксирибонуклеотиды. Для исключения деградации затравки с 5 -конца в качестве ДНК-полимеразы применяется обычно фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. oli. [c.328]

Проведите расщепление 1—5 мкг гетерологичной ДНК подходящей рестриктазой и выделите нужный фрагмент методом электрофореза в агарозном геле. Если необходимо использовать ДНК-линкеры, после расщепления рестриктазой затупите концы ДНК. Тупые концы формируют путем достраивания укороченных З -концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I или удаления выступающих З -концов под действием 3 -5 -эндонук-леазной активности ДНК-полимеразы Т4 [14]. После пришивания линкеров к фрагменту с тупыми концами [14] надо получить липкие концы путем расщепления линкерной ДНК с помощью подходящей рестриктазы. [c.144]

N-концевой домен молекулы ДНК-полиме-разы IЕ. соН соединен со след)тощим доменом петлей из аминокислотных остатков (см. рис. 1.12), которая наиболее доступна действию протеаз. Поэтому при ограниченном протеоли-зе фермента субтилизином, трипсином или другими протеазами он распадается на два фрагмента, имеющих размер 68 кДа и 35 кДа. Меньший фрагмент обладает 5 -3 -экзонуклеазной активностью, а больший — 5 -3 -полимеразной и 3 -5 -экзонуклеазной активностями. Последний бифункциональный фрагмент принято называть фрагментам Кленова ДНК-полимера-зы IЕ. oli (по фамилии одного из описавших его авторов). Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (PolIK) можно выделить также из экстрактов Е. соИ. Происходит ли образование этого фрагмента в клетке или он формируется в процессе экстракции, пока не ясно. [c.25]

Рассмотренные свойства фрагмента Кленова ДНК-полимеразы IЕ. соН позволили Д. Гоед-делу с соавторами предложить в 1980 г метод репарации, направляемой праймером (primer ге- [c.25]

По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репари-руют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы IЕ. соИ. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований. [c.27]

Альтернативный методу Кораны способ конструирования искусственных протяженных фрагментов ДНК сформулирован в работе К. Итакуры с сотрудниками. В его основе лежит способность некоторых ферментов, в частности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, достраивать комплементарную цепь в присутствии праймера. Это свойство фермента эпизодически использовалось в рамках метода Кораны для удлинения олигонуклеотидов, в более поздних работах — для получения ДНК-дуплексов. [c.72]

П. Диллон и К. Розен, основываясь на том, что перекрываюишеся олигонуклеотиды могут быть использованы для синтеза ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, предложили применить двустадийную ПЦР и синтетические полинуклеотиды в качестве матрицы для синтеза искусственных генов. Ген Rev HIV-2, содержащий триплеты, предпочтительно использующиеся в Е. соН, получали из четырех частично перекрывающихся полинук- [c.75]

Кроме того, фрагменты ДНК, генерированные рестриктазами или Alul, могут быть клонированы в векторах серии pBR и затем вы-щеплены как ЕсоШ-, ВатШ- или 5аЛ-фрагмен-ты. Этого можно достичь путем расщепления вектора одним из трех ферментов с последующей достройкой липких концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I до тупых и встройки ipRI- или /4/м1-фрагментов по тупым концам с помощью ДНК-лигазы фага Т4. При та- [c.92]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология