Векторы клонирующие

Векторы на основе бактериофага Л С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек час- [c.71]

Рис. 4.1. Клонирование рекомбинантной ДНК. Донор-ную ДНК расщепляют рестрицирующей эндонуклеазой и встраивают в клонирующий вектор. Полученную конструкцию вводят в попу ляцию клеток-хозяев, идентифицируют те клетки, которые содержат рекомбинантную ДНК, и культивируют их. При необходимости можно индуцировать экспрессию клонированного гена в клет-ках-хозяевах и получить кодируемый им белок.

Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицирующей эндонуклеазы Abel и отделяют от векторной ДНК. . Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей.

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атр ) в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы АЬс и укороченный ген -галактозидазы (la Z). Ген, который хотят клонировать, встраивают в Ab l-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

ДНК попадает в ядро. Однако вирусные векторы имеют ряд недостатков они дорогостоящи и часто обладают ограниченной клонирующей емкостью, что не позволяет регулировать экспрессию терапевтического гена с помощью тканеспецифичных последовательностей. Кроме того, вирусные белки могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Поэтому были разработаны невирусные системы доставки генов. [c.499]

Рис. 6.5. Клонирующий вектор pAVlO (без соблюдения масштаба). Показано положение гена устойчивости к тетрациклину (Tef), сайта рестрикции для эндонуклеазы Bglll, сайта инициации репликации (ori), промотора (р) и полилинкера (ПЛ). Встраивание клонированного гена в полилинкер ставит его под контроль промотора Тп5 (р). Стрелка указывает направление транскрипции.

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага M13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК M13 клетки Е. соИ. Часть образующихся в клетках фаговьгх частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую [c.175]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда фирма Genente h впервые предложила обществу свои акции, это была небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до этого ученым компании удалось выделить фрагменты гена (последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести их в генетические элементы (клонирующие векторы), способные реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки Es heri hia oli). Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по производству человеческого инсулина, который после соответствующей очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять лет назад такое развитие событий представ- [c.15]

Из организма - донора нужных генов - экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мищень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция клонирующий вектор-встроенная ДНК ). [c.50]

Один из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5 "-концевой сегмент гена ompF Е. соН, кодирующего один из наружных мембранных белков, и прилегающую к нему часть гена la Z (Р-галактозидазы) Е. соИ (рис. 6.7). Этот сегмент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген la Z лищен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. В такой [c.113]

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена El, двумя участками генома аденовируса (рис. 21.7). Один из них может существовать в виде плазмиды в Е. соИ и содержит вместо El-области терапевтический ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5 -концевого участка, включающего Е1-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо El-области находится терапевтический ген. Продукты гена El, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. Клонирующая емкость аденовирусного вектора [c.494]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Ti-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены. [c.377]

Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода. В первом случае используют бинарную векторную систему (рис. 17.6, А). Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации и для Е. соН, и для А. tumefa iens, но не несет генов vir, т. е. это практически челночный вектор Е. соН -А. tumefa iens. Все стадии клонирования прово- [c.377]

Для создания STS были разработаны различные подходы. В одном из них ДНК из очищенного препарата одной хромосомы человека, изолированной при помощи проточной цитофотометрии, обрабатывают рестриктазой и клонируют в векторе, способном акцептировать небольшие (<1000 п. н.) фрагменты ДНК. Затем секвенируют вставки из клонов, выбранных случайным образом, и отбрасывают те клоны, в которых вставки короче 100 п. н., и те, которые содержат последовательности из повторяющихся элементов ДНК человека. Наличие повторов определяют при помощи компьютерных программ, сравнивая нуклеотидную последовательность вставки с последовательностями всех известных повторов ДНК человека. Затем для каждого отобранного клона находят нуклеотидные последовательности праймеров. Каждый STS тестируют на предмет уникальности амплифицируемого фрагмента хромосомной ДНК. [c.463]

Адаптер (Adaptor) 1. Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким. После пришивания адагггора тупым концом к ДНК-мишени последнюю можно встраивать в подходящий вектор, используя приобретенный ею липкий конец. 2. Синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, у которого после самогибридизации появляются липкие концы и внутренний сайт для рестрицирующей эндонуклеазы. Когда адаптор встраивают в клонирующий вектор, у последнего появляется новый сайт рестрикции. [c.543]

Вставка (Insert) Сегмент ДНК, встроенный в клонирующий вектор. [c.545]

Двухцистронный вектор (Di istroni ve tor) Клонирующий вектор, предназначенный для экспрессии двух генов в одной клетке млекопитающих. Гены находятся под контролем одного промотора и сигнала полиаденилирования. [c.547]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология