ДНК линкерная

Рис. 30.1. Благодаря нуклеосомному фазированию сайты рестрикции попадают в уникальные положения линкерных участков, которые разрезаются нуклеазой микрококков.

Один из вариантов линкерных последовательностей, так называемые адапторы , час- [c.85]

Рис. 9-23. Строение нуклеосом. Нуклеосомные частицы состоят из двух полных витков ДНК (83 нуклеотидных пары на виток) закрученных вокруг кора, представляющего собой гистоновый октамер, и соединяются между собой линкерной ДНК. Нуклеосом-ная частица выделена из хроматина путем ограниченного гидролиза линкерных участков ДНК микрококковой нуклеазой. В каждой нуклеосомнои частице фрагмент двойной спирали ДНК, имеющий в длину 146 пар оснований, закручен вокруг гистонового кора. Этот белковый кор содержит по две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Полипептидные цепи гистонов насчитывают от 102 до 135 аминокислотных остатков, а общий вес октамера составляет приблизительно 100000 Да. В деконденсированной форме хроматина каждая бусина связана с соседней частицей нитевидным участком

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой. [c.117]

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Короткие фрагменты ДНК (8-12 пар оснований), используемые для получения липких концов (линкерная ДНК) [c.222]

Четко ограниченный размер полосы ДНК, образованной в результате первого расщепления нуклеазой микрококков, говорит о том, что область, непосредственно доступная для действия фермента, ограничена. К ней относится только часть каждого линкера. (Если бы вся линкерная ДНК была чувствительна, размер полосы колебался бы в интервале от 146 п.н. до отрезка, превышающего размер повторяющейся единицы). Но, после того как линкерная ДНК разрезана, оставшаяся часть становится чувствительной и довольно быстро расщепляется ферментом. [c.363]

Какова физическая природа минимальной нуклеосомы (нуклеосомного кора) и линкера Эти термины являются операциональными определениями для обозначения областей, относительно более и менее чувствительных к обработке нуклеазой. Из этого нельзя делать каких-либо выводов об их действительной структуре. Это не означает, в частности, что линкерная ДНК имеет более вытянутую форму, С другой стороны, путь ДНК в нуклеосоме может быть непрерывным без каких-либо четких различий между этими областями мономера. В действительности это условное рабочее предположение, которое часто делают, пытаясь перейти от структуры минимальной нуклеосомы к структуре нуклеосом. С другой стороны, возможно, что путь линкерной ДНК отличается от пути ДНК в минимальной нуклеосоме, о чем свидетельствуют заметные вариации в длине линкеров. [c.363]

Существование линкерной ДНК обеспечивается ка- [c.363]

Мы уже говорили, что гистон Н1 теряется при деградации мономерных нуклеосом. Он еще остается в мономерах, содержащих 160-170 п.н. ДНК, но всегда теряется при последующем уменьшении до минимальной хромосомы размером 146 п.н. На основании этого факта можно предположить, что гистон Н1 располагается в области линкерной ДНК, непосредственно прилегающей к ДНК минимальной нуклеосомы. [c.363]

И еще одно важное замечание нужно сделать относительно укладки ДНК в нуклеосоме и ее возможной степени суперспирализации. Все обсуждавшиеся данные были получены с использованием препаратов минимальной нуклеосомы. В моделях, объясняющих противоречивость данных о числе супервитков, предполагается, что линкерная ДНК уложена таким же способом, что и ДНК минимальной нуклеосомы. Однако способ укладки линкерной ДНК может быть иным. Анализ лестниц , полученных при расщеплении ДНКазой I фрагментов длиной более 1000 П.Н., свидетельствует в пользу того, что выходящая из кора ДНК уложена так же, как и ДНК кора. Это означает, что одна и та же периодичность разрезания сохраняется не только в отдельной нуклеосоме, но и между нуклеосомами. Другими словами, ДНК следует от одной нуклеосомы к другой, не нарушая способа организации, по крайней мере насколько это видно из периодичности разрезания. [c.368]

Предположим, что определенная последовательность ДНК организована в нуклеосомы только одной конфигурации так, что каждый участок в ДНК локализован в нуклеосоме всегда в одном и том же положении. Это называют фазированием нуклеосом. В серии фазированных нуклеосом линкерные области ДНК заключают в себе уникальные сайты. [c.376]

Что происходит в том случае, если нуклеосома не занимает одно-единственное положение Эта возможность рассматривается на рис. 30.2, где показано пять возможных способов локализации нуклеосомы на одной последовательности ДНК. Но в действительности их может быть столько, сколько пар оснований находится в повторяющейся единице. В этом случае в каждой копии генома линкерная ДНК состоит из разных последовательностей ДНК. Сайты рестрикции каждый раз лежат в разном положении. В действительности они могут находиться во [c.377]

Фазирование нуклеосом может осуществляться одним из двух способов. Один из них заключается в том, что каждая нуклеосома располагается специфически на определенной последовательности ДНК. Это несколько противоречит представлению о том, что нуклеосомная субъединица может образоваться в результате соединения любой последовательности ДНК с гистоновым октамером. Второй возможный способ связан с существованием некой специфической последовательности, которая предпочтительно участвует в образовании первой нуклеосомы на данном участке, а затем начинается последующее образование нуклеосом с определенным размером нуклеосомного повтора. (Если в конструкции нуклеосом существует некоторое разнообразие-например, если длина линкерного участка может варьировать, скажем, на 10 п. н.,-место специфической локализации будет постоянно смещаться по мере удаления от первой фиксированной нуклеосомы.) Стартовую точку образования нуклеосом можно определить путем связывания негистоновых белков со специфическим сайтом ДНК. [c.378]

Если расположение нуклеосом на ДНК происходит случайным образом, то все сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, рано или поздно окажутся в линкерной области, став доступными для действия фермента. Картина расположения полос при расщеплении хроматина и ДНК будет одинаковой. Но, если нуклеосомы лежат в упорядоченных местах (фазированы), некоторые сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, будут вне пределов досягаемости, так как окажутся в пределах минимальной нуклеосомы. Тогда отдельные полосы, обнаруживаемые при электрофорезе расщепленной ДНК, будут отсутствовать в электрофореграммах расщепленного хроматина. Если же при образовании нуклеосом возникают новые чувствительные сайты, то в электрофореграммах расщепленного хроматина можно будет обнаружить новые полосы. Таким образом, различие в расположении полос при расщеплении контрольной ДНК и хроматина доказывает существование фазирования нуклеосом. Такие эксперименты действительно были выполнены. [c.379]

ЛИНКЕРНАЯ ДНК. ДНК нуклеосомы, выходящая за пределы кор-частицы (минимальной нуклеосомы) длиной 146 п.н. [c.523]

СВЯЗЬ ВАНИЕ ЧЕРЕЗ ВНЕКЛЕТОЧНУЮ ЛИНКЕРНУЮ МОЛЕКУЛУ [c.519]

Н1, Н2, НЗ, Н4, Н5), различающихся по содержанию (%) основных аминокислот, обусловливающему их физико-химические свойства (электрофоретическую подвижность, ИЭТ и др.). Гистоны являются эволюционно консервативными белками. Степень гомологии аминокислотных последовательностей гистонов Н2, НЗ, Н4, Н5 у разных видов животных, растений и грибов достаточно высока. Эти гистоны попарно образуют октамеры (белковые коры дисковидной формы, которые оплетаются молекулой ДНК). Участок ДНК, спирально оплетающий октаметр, содержит в среднем 145—150 нуклеотидных пар и формирует примерно 1,75 витка левой спирали. Свободные от контакта с белковыми корами участки ДНК называют линкерными (или связующими). Их длина варьирует в за- [c.182]

На основе такого анализа можно разделить нуклеосомную ДНК на две части. ДНК минимальной нуклеосомы имеет постоянную длину 146 п.н. и относительно устойчива к расщеплению нуклеазами. (Другие нуклеазы, в том числе и нуклеаза микрококков, останавливаются перед этим отрезком ДНК.) Линкерная ДНК заключает в себе остаток повторяющейся единицы. Ее длина может варьировать in vivo от такого малого размера, как 8 п. н., до такого большого, как 114 п.н., на 1 нуклеосому. [c.363]

Эти результаты проливают некоторый свет на природу межнуклеосомного сайта, разрезаемого нуклеазой микрококков. Вероятно, фермент разрезает линкерную ДНК не в наиболее открытой точке, а в предпочтительном сайте, ближайшем к этому положению (если такой есть). Поскольку положение таких сайтов может быть различным, ширина полос увеличивается. Способность сайтов предпочтительного расщепления привлекать к себе фермент, возможно, увеличивает количество положений в линкерной ДНК, наиболее доступных для нуклеазы микрококков. [c.379]

Рис. 11-38. Модель, показывающая, как трансмембранные линкерные гликопротеины плазматической мембраны могут соединять внутриклеточные актиновые филаменты с внеклеточным матриксом в фокальных контактах Фокальные контакты образуются, когда связывание гликопротеинов матрикса с поверхностью клетки приводит к группировке трансмембранных линкеров в области контакта (А). Справа (Б) показано возможное расположение внутриклеточных нрикренительных белков, осуществляющих связь между трансмембранными гликопротеинами-

Трудности, связанные с использованием простого делеционного анализа для уяснения влияния данной последовательности ДНК на экспрессию прилегающего к ней гена, заключаются в том, что удаление определенной последовательности фактически приводит к ее замещению на другую, граничащую с ней последовательность. Эта последняя сама по себе может содержать участки, способные оказывать определенное влияние на экспрессию искомого гена. Ввиду этого интерпретация истинной роли делетироваиной последовательности может оказаться весьма неоднозначной. Метод линкерного сканирования не полностью свободен от вышеупомянутого ограничения. В то же время для уяснения функциональной роли замещаемой последовательности этот метод следует признать более адекватным, поскольку он основан на замене природных последовательностей на стандартный фрагмент ДНК того же размера. [c.289]

В интактном хроматине ДНК тянется в виде непрерывной нити от нуклеосомы к нуклеосоме. Каждая нуклеосомная бусина отделена от следующей линкериой последовательностью, длина которой варьирует от О до 80 нуклеотидных пар. В среднем нуклеосомные частицы (нуклеосом-ный кор плюс линкерная последовательность) повторяются через каждые 200 нуклеотидов (см. рис. 9-23). Таким образом, эукариотический ген, состоящий из 10000 нуклеотидных пар, связан с 50 нуклеосомами, а в каждой клетке человека, ДНК которой насчитывает в х 10 нуклеотидных пар, содержится 3x10 нуклеосом. [c.112]

На некоторых участках ДНК нукдеосомы отсутствуют, несмотря на то, что длина этих участков составляет сотни нуклеотидных пар. Такие области можно выявить, обработав ядро клетки следовыми количествами дезоксирибонуклеазы (ДНКаза 1). Использование минимальных концентраций фермента обеспечивает разрушение длинных областей безнуклеосомной ДНК, при этом короткие участки линкерной ДНК, расположенной между нуклеосомами, останутся целыми. Хроматин, обработанный таким образом, расщепляется преимущественно по участкам, которые, по-видимому, не содержат нуклеосом. Обычно такие сайты отстоят друг от друга на расстояние нескольких тысяч нуклеотидных пар. [c.113]

Рис. 13-39. Гипотетическая схема, объясняющая наблюдаемую зависимость пролиферации нормальных и трансформированных клеток от адгезии между клетками и матриксом. Главное внимание уделяется двум типам молекул 1) цитоплазматическому белку, который служит внутриклеточным сигналом к делению, и 2) трансмембранному линкерному белку, который может связываться как с цитоплазматической сигнальной молекулой по одн) сторону клеточной мембраны, так и с внеклеточным матриксом по другую сторону. Это связывание -кооперативный проиесс, так что сигнальные молекулы, связавшиеся с линкерным белком внутри клетки, стабилизируют трансмембранную структуру и способствуют ее связыванию с внеклеточным матриксом и наоборот, связывание с внеклеточным матриксом способствует связыванию сигнальных молекул с линкерным белком внутри клетки. Чтобы клетка получила сигнал к делению, сигнальные молекулы должны быть несвязанными в цитоплазме и находиться в активной конформации, в которой они менее прочно связываются с линкерным белком Предполагается, что сигнальные молекулы активируются при их фосфорилировании, которое происходит благодаря киназной активности

Когда прикрепленную клетку стимулируют факторы роста (А), включается киназная активность сигнальные молекулы фосфорилируются и отсоединяются от линкерных белков, что служит для клетки сигналом к делению и ослаблению адгезии. Нормальные клетки в суспензии (Б) не делятся при воздействии факторов роста потому, что очень мало сигнальных молекул внутри клетки связывается с линкерными белками, которые могли бы их фосфорилировать. Трансформированные клетки (В) отличаются пониженной адгезивностью и могут делиться даже в суспензии, так как в их регуляторной системе имеется шунт , благодаря которому сигнальные молекулы всегда находятся в фосфорилировашюм [c.435]

Рис. 14-7. Схема функциональной роли двух грунн белков, образующих прикрепительные контакты внутриклеточных прикрепительных белков и трапсмембраппых липкерпых глико протеинов. В данном примере внеклеточные домены трансмембранных линкерных гликопротеипов, скрепляющих клетки, взаимодействуют непосредственно. В других случаях они могут быть соединены дополнительными белками, находящимися во внеклеточном пространстве. Комплексы внутриклеточных прикрепительных белков связывают линкерные гликопротеипы с цитоскелетом.

Прежде чем рассматривать различные классы прикрепительных контактов, следует вкратце охарактеризовать общие принципы их структуры. Как показано на рис. 14-7, все эти соединения состоят из белков двух гипов 1) внутриклеточных прикрепительных белков, которые связывают соединительный комплекс со специфическими элементами хщтоскелета (актиновыми или промежуточными филаментами), и 2) трансмембранных линкерных гликопротеипов, внутриклеточные домены которых связаны с одним или несколькими внутриклеточными прикрепительными белками, а внеклеточные домены взаимодействуют либо с внеклеточным матриксом, либо с внеклеточными доменами трансмембранных линкерных гликопротеипов другой клетки. [c.478]

Рецептор фибронектина - это только один представитель обширного семейства трансмембранных линкерных гликопротеипов, называемых интегринами (разд. 14.2.17), которые, но-видимому, связывают пучки актиновых филаментов с внеклеточным матриксом. Некоторые интегрины хорошо изучены, и на их примере видно, как трансмембранные линкерные гликопротеипы, участвующие в межклеточной адгезии (кадгерины и др.), могут соединять пучки кортикальных актиновых филаментов соседних эпителиальных клеток однако в адгезионных поясах винкулин присутствует без талина. [c.480]

Рис. 14-26. Схема соединения гликозаминогликановой цепи с серином сердцевинного белка в молекуле протеогликаиа К серину [который часто находится внутри последовательности Asp (или Glu)-Asp-(или Glu)-X-Ser-Gly-X-Giy, где X -любая аминокислота] присоединен специфический линкерный трисахарид . Остальная часть цепи гликозаминогликана. построенная в основном из повторяюшихся дисахаридных единиц (состоящих в свою очередь из двух моносахаридов А и В, приведенных в табл. 14-2), синтезируется позднее путем последовательного

Проведите расщепление 1—5 мкг гетерологичной ДНК подходящей рестриктазой и выделите нужный фрагмент методом электрофореза в агарозном геле. Если необходимо использовать ДНК-линкеры, после расщепления рестриктазой затупите концы ДНК. Тупые концы формируют путем достраивания укороченных З -концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I или удаления выступающих З -концов под действием 3 -5 -эндонук-леазной активности ДНК-полимеразы Т4 [14]. После пришивания линкеров к фрагменту с тупыми концами [14] надо получить липкие концы путем расщепления линкерной ДНК с помощью подходящей рестриктазы. [c.144]

Гистоны составляют около половины массы хромосомы, где они участвуют в организации нескольких уровней упаковки двойной спирали ДНК. Вместе с другими белками гистоны образуют с ДНК комплексы, названные хроматином. Впервые Р. Корнберг в 1974 г. выделил повторяющуюся структурную единицу хроматина и вместе с Дж. Томасом установил, что она состоит из белковой сердцевины октамерного кора, содержащего по две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, и фрагмента двойной спирали ДНК [402, 403]. Р. Симпсон предположил, что двухцепочечная ДНК закручена вокруг гистонового кора и образует два витка суперспирали из 165 пар оснований [404]. Позднее эта цифра была исправлена А. Клагом и соавт. на 146 [405]. Обнаруженная структурная единица хроматина получила название нуклеосомы [406]. Исследования гистонового кора с помощью различных физико-химических методов показали, что октамер представляет собой гетерогенный белковый ансамбль (Н2А-Н2В-НЗ-Н4)2, состоящий из трех структурных субъединиц тетрамера (НЗ-Н4)2 и двух димеров (Н2А-Н2В). Двойная спираль ДНК в хроматине тянется как непрерывная нить от одной нуклеосомы к другой. Расположенные между нуклеосомами линейные линкерные участки ДНК имеют разную длину, которая обычно невелика и в среднем составляет 60 нуклеотидов. Нуклеосомная нить определяет более высокие уровни компактизации хроматина. В конечном счете, он предстает в электронном микроскопе в виде так называемой ЗОнм-хроматиновой фибриллы. [c.110]

За укладку нуклеосомной нити в составе хроматиновой фибриллы отвечает гистон Н1. Центральная часть его молекулы представляет собой глобулу, которая взаимодействует со специфическим участком нуклеосомы. М- и С-концевые фрагменты белка имеют вытянутые формы. Один из них (М-) ассоциирован с предшествующей линкерной ДНК в области ее контакта с нуклеосомной частицей, а другой - с гистоновым кором последующей нуклеосомы. Кроме того, замечено, что свободная молекула Н1 легче взаимодействует с ДНК в непосредственной близости от другой, уже присоединившейся молекулы гистона, чем отдельно от нее [407]. Этим обусловлена склонность белков Н1 связываться с ДНК группами по восемь и более молекул. Предполагается, что взаимодействие такого типа, названное кооперативным связыванием, лежит в основе активации генов. Вызванная им конденсация молекул гистона Н1 превращает некоторые хроматиновые участки в своеобразные микрокристаллы, "плавление" которых под действием внешнего регуляторного сигнала ведет к разрушению гистонового кластера и локальной перестройке хроматина [401, 408]. [c.110]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология