Целлюлоза ковалентно связанная с антигенам

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

И целлюлозу вновь суспендируют в буферном растворе (0,05М 2-аминоэтанол — ОДМ бикарбонат натрия, pH 8,9), чтобы удалить непрореагировавший бром. После 24-часовой выдержки при 4°С несвязанный антиген удаляют центрифугированием, суспензию конъюгата промывают раствором 0,15М хлорида натрия до полного исчезновения антигена в супернатанте (контро--лируется по поглощению при 280 нм). Для того чтобы на целлюлозе остался только ковалентно связанный антиген, ее вновь суспендируют в 30 мл 8М раствора мочевины и медленно перемешивают 24 ч при комнатной температуре. После центрифугирования промывку 8М раствором мочевины повторяют до исчезновения антигена (контролируется по поглощению при 280 нм). Далее конъюгат перемешивают в течение часа при 37 °С в 0,1М уксусной кислоте. В этих условиях антиген не должен элюироваться с целлюлозы. После центрифугирования конъюгат суспендируют в 0,15М фосфатном буфере, pH 7,4 и хранят при [c.40]

Как было показано выше, целлюлоза была первым носителем в аффинной хроматографии. Обзор данных по применению целлюлозы для выделения антител и антигенов приведен в работе [81]. Данные о ковалентном связывании нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот обобщены в статье [33]. Хотя в настоящее время в аффинной хроматографии применяются и другие твердые носители, целлюлоза не потеряла своего значения. Трипсин, связанный с целлюлозой, по-прежнему ис- [c.40]

Аффинная хроматография как метод, по-видимому, впервые была применена Штаркенштайном в 1910 г. [21] для выделения а-амплазы с помощью нерастворимого субстрата (крахмала). Принцип аффинной хроматографии, использующий аффинанты, ковалентно связанные с нерастворимой матрицей, известен более 20 лет. Кемпбелл и др. [6] были, вероятно, первыми (1951 г.), в чьих работах этот принцип получил практическое приложение для выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была применена в 1953 г. Лерманом [15], который выделил тирозиназу на колонке с целлюлозой, эфирно связанной с остатками резорцина. В последующие годы аффинная хроматография использовалась весьма редко, что, очевидно, об- [c.15]

Антисывороткн, ковалентно связанные с агарозой, целлюлозой и сефадексом, в системах радиоиммуноанализа белков и гаптенов исследовались Болтоном н Хантером [135], Показано, что ковалентное связывание с нерастворимой матрицей е оказывает неблагоприятного влияния на антисыворотку. Ухудшение чувствительности анализа обусловлено в большинстве случаев иространствен-ными затруднениями для высокомолекулярных антигенов. Богданов и Страш [131] указали на возможные ошибки радиоиммуно-анализа, возникающие из-за большого объема атома радиоактивного иода. [c.381]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология