Гидролиз дисульфидный обмен

Как уже отмечалось ранее, фрагментацию белков следует проводить в условиях, исключающих дисульфидный обмен предпочтительно в диапазоне pH 2—6,5. Тем не менее для достижения удовлетворительных результатов часто приходится вести реакцию в области более основных pH. Например, с успехом применяют гидролиз трипсином и термолизином при pH 7,0— 7,5 [19, 30, 41, 42]. Однако ввиду различной стабильности дисульфидных связей в белках при объяснении полученных результатов в этом случае не следует делать поспешных выводов. [c.169]

Последовательность операций на этой стадии следующая вначале проводится ферментативный гидролиз нативного белка в условиях, исключающих дисульфидный обмен (т. е. при pH ниже 7,0), полученная смесь пептидов фракционируется и у выделенных ци-стинсодержащих фрагментов после восстановления дисульфидной саязи определяется аминокислотная последовательность. Разделе- [c.75]

Условия гидролиза. Пепсин проявляет активность в диапазоне pH 1—5 (оптимальные условия pH 2,0). Гидролиз проводят в 10 мМ НС1 или 5%-ной уксусной кислоте. Фермеь1т необратимо ингибируется при рН>6,0. Наиболее удачные результаты дает применение пепсина при определении положения дисульфидных связей, так как дисульфидный обмен минимален именно при низких pH инкубация с пепсином приводит к получению коротких пептидов с правильно замкнутыми дисульфидными СВЯЗЯМИ [101] (см. также разд. 4.4.2). [c.158]

В цикле работ по определению структуры инсулина Сенгер и др. [35—37] впервые наблюдали дисульфидный обмен при частичном гидролизе белка в конц. НС1 на холоду. При более детальном исследовании на модельных системах, включающих бис-2,4-динитрофенил-ь-цистин (бис-ДНФ-цистин) и цистилбис-глицин или окисленный глутатион, установлено, что реакция дисульфидного обмена протекает как в концентрированных минеральных кислотах, так и в слабоосновной среде, правда, по различному механизму. В кислой среде обмен ингибируется тиолами, в основной среде тиолы служат катализаторами, а SH-реагенты ингибиторами [35]. В этой же работе найдены условия частичного гидролиза инсулина с сохранением положения дисульфидных мостиков, благодаря чему было определено их положение в молекуле гормона. В работе [41] на примере взаимодействия цистина с окисленным глутатионом изучена стабильность дисульфидных связей в различных условиях при этом показано, что дисульфидный обмен минимален при pH 2—6,5. Кроме того, при протеолизе рибонуклеазы в условиях, способствующих дисульфидному обмену, получены ци-стинсодержащие пептиды, включающие лишь две из четырех [c.165]

Иногда гидролиз трипсином проводят при нейтральном или слабощелочном значении pH, однако при этом необходимо доказать, что не происходит дисульфидного обмена. Фрагменты человеческого иммуноглобулина IgG (полученные при расщеплении белка бромоцианом) инкубировали с трипсином (27о) при pH 7,2 в течение 4 ч [19]. При гидролизе в присутствии избытка [С " ] иодоацетамида показано, что белок не содержит нестабильных дисульфидных связей. В аналогичных условиях проводили триптический гидролиз фрагмента иммуноглобулина IgG (полученного при гидролизе белка пепсином), однако в отсутствие контроля за дисульфидным обменом [42]. Положение двух из четырех дисульфидных связей кардиотоксина яда кобры определено по строению цистинсодержащих пептидов, полученных при гидролизе белка трипсином при pH 7 в течение 24 ч [30]. Дополнительные сведения приводятся в разд. 3.5.1. [c.171]

Следует отметить, что при модификации и гидролизе белок выдерживают в нейтральной или слабоосновнон среде, т. е. в условиях, в принципе не исключающих дисульфидный обмен. Относительно малеилирования см. разд. 3.4.2.2. [c.173]

Для определения локализации дисульфидных связей белок подвергают частичному гидролизу на относительно малые фрагменты с помощью протеиназы низкой специфичности, такой как пепсин, в условиях, при которых протекает минимум обменных реакций. Пептиды разделяют и определяют их аминокисло гный состав для того, чтобы убедиться в том, что они гомогенны и содержат одну дисульфидную связь. Дисульфидная связь в каждом пептиде разрывается (см. разд. 23.3.3) и образуются два фрагмента. Если первичная структура белка известна, то достаточно аминокислотного анализа и частичного определения Л/-концевой последовательности в двух фрагментах для того, чтобы определить ту часть цепи (ей), из которой образовался каждый фрагмент. [c.280]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология