Иодоацетамид

Реакционную смесь охлаждают до О С, добавляют небольшой избыток (в расчете на 5Н-группу) перекристаллизованной иодоуксусной кислоты или иодоацетамида и инкубируют без доступа света. В процессе реакции в среде поддерживают pH 8,0. Спустя 1 ч избыток реагента нейтрализуют с помощью [c.85]

Расщепить пептиды по остатку метионина можно с помон ью агентов, алкилирующих тиоэфирную группу по механизму реакции, аналогичному расщеплению бромоцианом. Наиболее эффективным реагентом оказался иодоацетамид [109, ПО]. При обработке апокаталазы этиленимином идет реакция присоединения по тиоэфирной группе метионина с образованием амино-этилсульфониевой соли с последующим расщеплением пептидной связи [166]. В сочетании с методом диагонального электрофореза эту реакцию применяли для идентификации и выделения пептидов, содержащих остатки метионина [187, 188]. [c.101]

Карбоксиметилирование. Карбоксиметилирование — наиболее общепринятый метод модификации сульфгидрильных групп белков. Для введения кислотных или нейтральных группировок Б качестве реагентов используют иодоуксусную кислоту или иодоацетамид. Предварительно оба реактива перекристал-лизовывают для удаления свободного иода. Иодоуксусную кислоту перекристаллизовывают из гексана, иодоацетамид — из петролейного эфира. Оба реагента добавляют в реакционную [c.142]

После восстановления в мягких условиях дитиотреитом молекула человеческого иммуноглобулина 1дО присоединяет 8 молей [ " С] иодоацетамида, в то время как нативный белок присоединяет всего 0,5 моля этого реагента. Поскольку восстановление проводят в условиях, обеспечивающих полную диссоциацию полипептидных цепей, это означает, что молекула иммуноглобулина имеет не более четырех межцепочечных дисульфидных мостиков. Следовательно, остальные 26 остатков полуцистина, найденные по данным аминокислотного анализа, образуют внутрицепочечные связи. Более того, распределение меченых остатков в отдельных цепях свидетельствует о том, что каждая легкая цепь связана с тяжелой одной дисульфидной связью, а две тяжелые цепи соединены двумя дисульфидными мостиками. [c.168]

Иногда гидролиз трипсином проводят при нейтральном или слабощелочном значении pH, однако при этом необходимо доказать, что не происходит дисульфидного обмена. Фрагменты человеческого иммуноглобулина IgG (полученные при расщеплении белка бромоцианом) инкубировали с трипсином (27о) при pH 7,2 в течение 4 ч [19]. При гидролизе в присутствии избытка [С " ] иодоацетамида показано, что белок не содержит нестабильных дисульфидных связей. В аналогичных условиях проводили триптический гидролиз фрагмента иммуноглобулина IgG (полученного при гидролизе белка пепсином), однако в отсутствие контроля за дисульфидным обменом [42]. Положение двух из четырех дисульфидных связей кардиотоксина яда кобры определено по строению цистинсодержащих пептидов, полученных при гидролизе белка трипсином при pH 7 в течение 24 ч [30]. Дополнительные сведения приводятся в разд. 3.5.1. [c.171]

РИС. 6.7. Гель-хроматография белков на колонках TSK SW в растворах Gu-H I. Белки восстановлены и алкилированы иодоацетамидом [9]. а—использованы три колонки TSK SW. Элюент — 6 М Gu-H I, содержащий 0,1 М NaH2P04, pH 6. Эталонные смеси белков содержали 1 — тиреоглобулин, 2 БСА, 3 — овальбумин, 4 — миоглобин, 5 — цитохром с, 6 — инсулин б—градуировочные графики для белков, разделенных в 6 М Gu H i на колонках TSK SW. [c.208]

Замечание. Метод не очень чувствителен (—50 мкг), но прост и дает линейную зависимость поглощения от концентрации вплоть до 1000 мкг белка. Окраска стабильна в течение не менее 1 ч. Добавление иодоацетамида (12,5 мкг) необходимо для исключения влияния больших количеств дитиотреита. Реагент ЭДТА (661 превосходит по хелатирующей способности тар-трат [129], что позволяет полностью исключить влияние сульфгидрильных соединений. [c.297]

До проведения ферментативного гидролиза образец белка должен быть денатурирован и остатки цистеина в нем превращены в гидрофильные производные. С этой целью дисульфидные связи в белке предварительно восстанавливают дитиотреитом [37] и цнстеины модифицируют иодоуксусной кислотой (для введения радиоактивной метки используют [ С] иодоуксусную кислоту), иодоацетамидом [31], этиленимином [66] или окисляют надмуравьиной кислотой [30]. Выбор реагента определяется общей стратегией исследования. Более подробно реакции модификации рассмотрены в гл. 2. [c.349]

ФТГ- ys. Методика идентификации остатков ys зависит от природы химической модификации сульфгидрильной группы остатка цистеина до анализа на секвенаторе. Для количественной оценки содержания цистеина наиболее удобно использовать меченое [С ]-карбоксиметильное производное, полученное восстановлением и последующим алкилированием образца [С ]-иодоацетамидом. Все отщепленные остатки проверяют на наличие радиоактивности. Кроме того, можно определить время элюирования соответствующего производного цистсина, оценить количественно его содержание и использовать эти данные для хроматографической оценки содержания ys. Можно анализировать и ФТГ-производное цистеиновой кислоты, однако оно элюируется с колонки очень быстро, и при наличии многих соединений, также выходящих с колонки, содержание ФТГ-производного цистеиновой кислоты трудно оценить (тем более количественно). [c.417]

Готовят 5%-ный раствор твина-40 в буфере трис/140 мМ Na l, pH 7,4 (для растворения твина-40 смесь надо подогреть, а после растворения вновь охладить). Добавляют равный объем раствора твина-40 к взвеси или гомогенату клеток. На этом этапе можно ввести ингибиторы протеиназ, например, 2,5 мМ иодоацетамида и 0,5 мМ ФМСФ. [c.189]

К препарату мембран в трис-буфере, pH 8 (концентрация белка 3—4 мг/мл), добавляют равный объем 4%-ного раствора дезоксихолата в том же буфере, содержащем 5 мМ иодоацетамида и 0,5 мМ ФМСФ. Важно, чтобы весовое отношение дезоксихолат белок было не меньше чем 10 1. Если необходимо, конечная концентрация дезоксихолата может превышать 2%. В свое время мы использовали различные концентрации [c.190]

Супернатант наносят на колонку с иммобилизованными антителами или замораживают и хранят при —40 °С. После размораживания к препарату нужно вновь добавить ингибиторы протеиназ (1 мМ иодоацетамида и 0,2 мМ ФМСФ), перемешать в течение часа и затем центрифугировать, как описано выше. После размораживания в препарате всегда присутствует некоторое количество нерастворимого материала, однако потери антигенной активности при замораживании — оттаивании мы не отмечали. [c.190]

Осадок суспендируют в 1,25 л 3%-ного раствора дезоксихолата в 30 мМ трис-НС1 буфере, pH 8, содержащем 0,02% К аЫз, 1 мМ иодоацетамида, 0,1 мМ ФМСФ. Затем подвергают краткосрочной обработке сначала в гомогенизаторе Уоринга, а затем Поттера — Элвейджема (см. разд. 5.2.4). [c.191]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология