Профлавин, связывание с активным центром

Обработкой данных табл. 18 в координатах Лайнуивера-Берка можно показать, что профлавин является конкурентным ингибитором а-химотрипсина. Однако зависимость в координатах (Кт(кяж), [I]) в данном случае является нелинейной (рис. 68), в отличие от простого конкурентного типа ингибирования. Одной из возможных причин подобной зависимости может быть связывание с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора [c.141]

Краситель профлавин связывается с активным центром химотрипсина, при этом спектральные свойства его изменяются. Наблюдаемое смещение спектра можно положить в основу метода измерения констант скоростей и равновесий нри образовании и распаде фермент-субстратных промежуточных продуктов, поскольку взаимодействие субстрата с активным центром предотвращает связывание красителя [8]. [c.48]

При изучении методом температурного скачка кинетики связывания профлавина с активным центром а-химотридсина было обнаружено, что кинетическая кривая является суммой двух экспоненциальных зависимостей. В табл. 19 приведены значения времен релаксации для ряда равновесных концентраций фермента и [c.201]

При смешивании эфира (например, этилового эфира ацетил-L-фенилаланина) с химотрипсином и профлавином происходит следующее. Связывание субстрата с ферментом сопровождается быстрым вытеснением некоторого количества профлавина из активного центра, что приводит к уменьшению А465. Когда образуется ацилфермент, равновесие между эфиром и профлавином при их связывании ферментом смещается, приводя к полному вытеснению профлавина. Поглощение остается постоянным до тех пор, пока не израсходуется весь эфир и не исчезнет ацилфермент. Зная количество вытесненного на первом этапе профлавина, можно рассчитать константу диссоциации фермент-субстратного комплекса, а из второй, экспоненциальной фазы получить константу скорости ацилирования. [c.217]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]