Блоттинг по Саузерну

Рис. 19.6. Блоттинг по Саузерну позволяет осуществить прямое выделение фрагментов ДНК, соответствующих специфическому зонду, из смеси рестриктов ДНК генома.

Рис. 19.7 При блоттинге по Саузерну фрагменты ДНК переносят с агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр.

Подобный анализ можно провести и для многих других заболеваний. Обычно точковые мутации идентифицируют путем определения нуклеотидной последовательности изучаемого гена, но, если мутация затрагивает сайт рестрикции, для ее выявления достаточно рестрикционного анализа. Делеции и вставки ДНК-фрагментов больших чем 50 пар оснований определяют методом блоттинга по Саузерну. [c.48]

Гель (рис. 1.12, Л) переносили с помощью блоттинга по Саузерну на микропористый фильтр и гибридизовали с af-специ-фичной пробой, как описано в гл. 5. Полученный радиоавтограф представлен на рис. 1.12, Б. Как в положительном контроле, так и в дорожках 3—7 можно видеть сильную и специ- [c.79]

Блоттинг по Саузерну обработанных рестриктазами и разделенных фрагментов ДНК [c.287]

Рис. 5.2, Схема блоттинга по Саузерну.

Гибридизация ДНК, перенесенной на мембраны с помощью блоттинга по Саузерну [c.293]

Все необходимое для блоттинга по Саузерну, как указано в разд. 5.4. [c.321]

Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным методом для установления локализации генов в фрагментах, полученных после гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомных ДНК и т. п. В частности, данный подход обеспечива- [c.57]

Объединение пульс-электрофореза с блоттингом по Саузерну позволяет картировать гены, анализировать перестройки в хромосомах, выявлять интеграцию чужеродных последовательностей в определенные хромосомы, изучать библиотеки клонированных крупных фрагментов ДНК и т. п. Все это обеспечивает новый, более высокий уровень молекулярно-генетического исследования различных организмов. [c.58]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Однако при наличии специфического зонда в пятне рестриктов можно обнаружить соответствующие ему последовательности. Последовательность операций такого метода приведена на рис. 19.6. Ключевой момент-денатурация ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где они иммобилизуются. Процесс переноса ДНК несколько похож на промокание (по-английски-блоттинг), и в разговорной речи этот термин используется для его обозначения. При работе с ДНК такой метод известен под названием блоттинга по Саузерну (Southern blotting) (по фамилии автора метода). [c.243]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Второй новый метод требует применения техники рекомбинантных ДНК и клонированных зондов ДНК для идентификации и количественной оценки аллельного полиморфизма. К настоящему времени выявлено более 100 полиморфных генов в геноме человека и установлена их хромосомная локализация банк этих данных быстро увеличивается. Они оказываются чрезвычайно удобными маркерами, даже если эти гены не экспрессируются в структурные или ферментативно-активные белки. Окрининг этих маркеров с помощью блоттинга по Саузерну в настоящее время используется, хотя и в небольших масштабах, при идентификации клеточных линий [32]. [c.146]

При анализе разделенных электрофорезом молекул ДНК широкое распространение получил метод переноса нуклеиновых кислот из агарозных гелей на нитроцеллюлозную бумагу, разработанный Е. Саузерном в 1975 г. в отечественной литературе его принято называть блоттингом по Саузерну (от англ. blotting — промокание). Сначала молекулы ДНК (или их фрагменты), разделенные по размерам электрофорезом в пластинах агарозного геля, денатурируют шелочью, после нейтрализации щелочи [c.56]

Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных описанным выще, ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подходящую подложку. Этот метод (блоггшг) широко используется, например, для идентификации специфических РНК и белков после их электрофоретического разделения (см. разд. 7.7 и 6.4 соответственно). Блоттинг ДНК назван по имени его изобретателя блоттингом по Саузерну (или саузерн-блоттингом) соответствующие методики для РНК и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга. [c.278]

Гены (1987) -- [ c.242 , c.243 ]

Генетика человека Т.3 (1990) -- [ c.127 , c.133 , c.148 ]

Молекулярная биология клетки Сборник задач (1994) -- [ c.129 , c.130 , c.139 , c.144 , c.177 , c.186 , c.187 , c.188 , c.189 , c.190 , c.250 , c.271 ]

Генетическая инженерия (2004) -- [ c.56 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология