Белки ферментативная активность

Высокая биологическая активность ферментов в первую очередь определяется характерными свойствами образующих их белков. Ферментативной активностью могут обладать как простые, так и сложные белки. Первые, как описано в предьщущей главе, состоят только из полипептидных цепей и гидролизуются до аминокислот (примерами могут служить ферменты пепсин, трипсин, уреаза и т. д.). Вторая группа ферментов представлена сложными белками, для проявления каталитической активности которых требуется присутствие веществ небелковой природы — простетических групп. Простетические группы ферментов, являющихся по химической природе сложными белками, называются кофакторами. [c.95]

В первой части книги кратко рассмотрено строение белков и активных центров ферментов, а также их свойства, важные для катализа. Более подробно изложены физико-химические механизмы катализа и ускорений, наблюдаемых как в ферментативных, так и в модельных процессах. [c.2]

Очистка и разделение белков (наряду с аминокислотным анализом) — основные области применения ионообменной хроматографии. Верно и обратное — в очистке любого белка этот вид хроматографии почти всегда занимает центральное положение. Поэтому при изложении общих соображений о выборе параметров хроматографического процесса в предыдущих разделах этой главы мы имели в виду прежде всего хроматографию белков. Был приведен соответствующий справочный и методический материал, отмечены аспекты, связанные с сохранением биологической активности и возможностью появления артефактов кажущейся утраты ферментативной активности и [c.301]

Фосфорилирование фермента не отражается на ферментативной активности при pH 8,0. Однако фосфорилирование белка оказывает влияние на аллостерические свойства фермента повышается чувствительность к ингибированию АТФ и цитратом, но снижается чувствительность к активирующему действию АМФ и фруктозо-2,6-дифосфата. Предполагают, что фосфорилирование индуцирует конформацион-ные изменения, способствующие смещению равновесия между двумя формами фермента активной и неактивной. При связывании АТФ в ингибиторном центре также происходит смещение равновесия в сторону неактивной конформационной формы фосфофруктокиназы. [c.238]

Теперь мы обратимся к краткому рассмотрению того, как описанные фотохимические изменения превраш,аются в электрический импульс, который стимулирует мозг. Существуют доказательства, что одиночный квант света может вызвать раздражение палочки сетчатки. Однако поглощение одного кванта еще не создает эффекта зрения. Для этого требуется попадание нескольких квантов (согласно разумной оценке, от двух до шести квантов) в одну и ту же палочку в течение относительно короткого временного промежутка. Но даже в этом случае процесс весьма эффективен, а энергия конечной реакции существенно превосходит энергию, поглощенную зрительным пигментом. Поглощение света инициирует цепь реакций, черпающих энергию из метаболизма. Тем самым зрительное возбуждение является результатом усиления светового сигнала, попадающего в сетчатку. Фоторецептор служит биологическим эквивалентом фотоумножителя, который преобразует кванты света в электрический сигнал с большим усилением и низким шумом (см. гл. 7). И фоторецептор, и фотоумножитель достигают большого коэффициента усиления с помощью каскада стадий усиления. Зрительные пигменты представляют собой интегральные мембранные белки, которые находятся в плазме и мембранах дисков внешнего сегмента фоторецептора. Фотоизомеризация ретиналя вызывает серию конформационных изменений в связанном с ним белке и тем самым образует или раскрывает ферментативный активный центр. Следует каскад ферментативных реакций, которые в конце концов дают нервный импульс. Электрический ответ начинается с кратковременной гиперполяризации, вызванной закрытием нескольких сотен натриевых каналов в плазматической мембране. Таким способом молекулы-посредники (мессенджеры) передают информацию от диска рецептора к мембране плазмы. Вероятным кандидатом на роль мессенджера является богатый энергией циклический фосфат цГМФ (гуанозин-3, 5 -цикломонофосфат), возможно, в сочетании с ионами Са +. Было показано, что катионная проводимость плазматических мембран палочек и колбочек прямо контролируется цГМФ. Таким образом светоиндуцированные структурные изменения диска активируют механизм преобразования, который сам генерирует потенциал, распространяющийся по плазматической мембране. В настоящее время детали механизмов преобразования и усиления продолжают исследоваться. Была предложена схема, основной упор в которой делается на центральную роль фосфодиэстеразы в процессе контроля за кон- [c.241]

Объяснять на основании известных вам сведений о белках следующие характеристики ферментов специфичность, температурная зависимость ферментативной активности, подобная указанной на рис. 25.6, ингибирование. [c.465]

Следует отметить, что многие белки сохраняют в монослоях свои ферментативные свойства и могут вступать в специфические реакции. Поэтому описываемые коллоидно-химические методы исследования пленок бел ков в совокупности с другими ценны для изучения различных свойств белков, они открывают путь к раскрытию механизма процессов обмена на границах раздела клеток и внутриклеточных структур в биологических объектах. Именно на таких границах происходит (в силу поверхностной активности) концентрирование биологически и физиологически активных веществ, проявляющих здесь свои важные специфические свойства (например, ферментативную активность). [c.66]

Эта область ионообменной хроматографии белков наиболее обширна. Сделаем попытку систематизации используемых здесь приемов, разделив их на шесть групп. Но прежде всего заметим, что постановке хроматографического опыта в любом случае должна предшествовать отработка метода идентификации очищаемого белка (путем обнаружения ферментативной активности или других биоло- [c.302]

Необходимое количество геля подбирают следующим образом. В несколько пробирок наливают одинаковое количество ферментного раствора (минимальный объем) и добавляют разные количества геля. Перемешивают до получения однородной суспензии, центрифугируют и в центрифуге определяют ферментативную активность. То соотношение геля к ферментному раствору, при котором в надосадочной жидкости остается примерно 90% первоначальной активности при адсорбции балластных белков и около 10% при адсорбции исследуемого фермента, считается оптимальным. На основании полученного соотношения рассчитывают количество геля, которое необходимо добавить на весь объем ферментного раствора. [c.204]

Удаление сульфата аммония. Фракцию белка, насыщенную сульфатом аммония до 50%, вновь хроматографируют на колонке в тех же условиях, как описано выше. Первые порции элюата, собранные сразу после выхода свободного объема колонки, содержат фермент. Этот раствор выдерживают в течение 2,5 ч при О—4° С. Образующийся осадок собирают центрифугированием (18 000 об/мин, 30 мин). Супернатант отбрасывают (предварительно проверяют на ферментативную активность). [c.243]

М в том же буфере. Общий объем растворов — 1 л. Скорость элюции — 20 мл/ч. Фракции белка с ферментативной активностью объединяют и диализуют против 80%-ного раствора сульфата аммония, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Фермент хранится несколько месяцев при О—4° С. [c.272]

Особенно поразительно то, что все белки во всех организмах, независимо от их функции или биологической активности, построены из одного и того же ос-новйого набора 20 стандартных аминокислот, каждая из которых, взятая в отдельности, не обладает никакой биологической активностью. Что же тогда придает одному белку ферментативную активность, другому-гормональную, а третьему-свойства антитела Как белки различаются химически Ответ довольно прост белки отличаются друг от друга тем, что кгждый имеет свою, характерную для него одного последовательность аминокислотных звеньев. Аминокислоты-это алфавит белковой структуры соединив их в различном порядке, можно получить почти бесконечное число последовательностей и, значит, почти бесконечное множество разнообразных белков (см. дополнение 6-1). [c.137]

Группа белков, принимающих участие в пептидил-трансферазной реакции, включает L2, L3, L4, L15 и L16. Попытки приписать какому-либо из этих белков ферментативную активность не увенчались успехом. Двумя наиболее возможными кандидатами являются белки L2 и L16. [c.113]

Огромное значение для молекулярной биологии последнего десятилетия имеет развитие генетической инженерии (возникшей в 1972—1973 гг. П. Берг, П. Лобан, С. Коэн и Г. Бойер) и методов работы с рекомбинантными ДНК в сочетании с методами химического синтеза крупных фрагментов ДНК. В результате сделались доступными для исследования индивидуальные гены и регуляторные генетические элементы, было стимулировано изучение ферментов биосинтеза и обмена нуклеиновых кислот. Благодаря этому после 1977 г. были обнаружены мозаичное (экзон-интронное) строение генов, явление сплайсинга и ферментативной активности у РНК, усилители ( энхансеры ) экспрессии генов, многие регуляторные белки, онкогены и онкобелки, мобильные генетические элементы. Возникла белковая инженерия, которая позволяет получать новые, не существующие в природе белки. Молекулярная биология начала оказывать существенное влияние на развитие биотехнологии, медицины и сельского хозяйства. [c.9]

Было бы утомительно проводить серию электрофоретических опытов при различных близких друг к другу значениях pH. Разумной альтернативой такой постановки опыта служит электрофорез в градиенте pH. Этот вариант метода, называемый изоэлектриче-ским фокусированием, является прямым аналогом равновесного центрифугирования в градиенте плотности. Молекулы, несущие и положительные и отрицательные заряды, называют амфолитами к ним относятся, например, полимеры, содержащие многочисленные амино- и карбоксильные группы. Смесь амфолитов с широким спектром изоэлек-трических точек вводят в колонку и ожидают, пока она не распределится по колонке под действием электрического поля. Таким способом достигается стабилизация градиента pH, в котором каждый конкретный амфолит оказывается около своей изоэлектрической точки. Для того чтобы избежать потерь биологического материала на аноде или катоде, на обоих концах градиента устанавливают такие значения pH, при которых у биологических материалов не может быть изоэлектрических точек. Чтобы подавить конвекцию, градиент pH создают в твердотельном носителе. В эту систему добавляют небольшое количество белка. Он мигрирует, пока не достигнет pH, соответствующего его изоэлектрической точке. Там он и концентрируется, образуя узкую зону. Чтобы проанализировать результаты такого опыта, можно просканировать гель и измерить поглощение белка можно также окрасить белок либо нарезать гель на тонкие слои и измерить в каждом слое pH, содержание белка, ферментативную активность или радиоактивность. [c.302]

При храненли проб слюны в первую очередь следует замедлить ее ферментативную активность, поскольку присутствующие в ней ферменты (амилаза, фосфатаза, эстеразы и пр.) могуг повлиять на метаболические изменения определяемых компонентов. Чтобы избежать поглощения следовых количеств суперэкотоксикантов стенками стеклянной посуды, слюну обычно хранят в склянках из фторопласта Заметим также, что в J юнe содержатся белковые вещества (альбумины, липопротеиды, глобулины и др.), поэтому необходимо принимать во внимание фактор связывания токсичных веществ белками [c.203]

Для жизненной функции клеток решающее значение имеют белки и нуклеиновые кислоты. Белки — главный органический компонент цитоплазмы. Некоторые белки относятся к структурным элементам клетки, другие — к имеющим важное значение ферментам. Радиационное повреждение белков состоит в уменьшении их молекулярной массы в результате фрагментации полипептидных цепочек, в изменении растворимости, нарушении вторичной и третичной структуры, агрегировании и т. п. Биохимическим критерием радиационного повреждения ферментов является утрата ими способности осуществлять специфические реакции. При интерпретации пострадиационных изменений ферментативной активности in vitro наряду с радиационными нарушениями самого фермента следует учитывать и другие повреждения клетки, прежде всего мембран и органелл. Чтобы вызвать явные изменения ферментативной активности в условиях in vitro, требуются значительно большие дозы, чем in vivo. [c.16]

К специфическим биологическим свойствам белков, измеияю-шнхся при денатурации, следует отнести уменьшение (иногда и увеличение) или потерю ферментативной и иммунологической активности. Обычно при денатурации снижается ферментативная активность биологических катализаторов, а субстраты белковой [c.210]

Таким образом, набор ферментативных активностей, необходимых для репликации генома данного вируса, задается схемой репликации, а происхождение соответствующих ферментов — вирусное нли клеточное — может быть разным. Вирусы с крупным геномом обычно имеют собственный набор репликационных ферментов и дополнительных белков, что, очевидно, делает вирусную репликацнонную систему более автономной от клетки-хозяина. [c.283]

Огромные успехи исследований механизмов кодирования наследственной информации и биосинтеза белка, ферментативного катализа и регулирования активности ферментов, действия антибиотиков и гормонов, всей той области изучения живого, которую принято называть молекулярной биологией, приучили всех к мысли о том, что в структурах молекул жизни положение буквально каждого атома строго обусловлено и подчинено выполнению предназначенных для этих молекул биологических функций. Именно в атом смысле принято обычно говорить о специфичности биополимеров, прочно ассоциировавшейся в сознании исследователей с однозначным соответствием между структурой и выполняемой функцией. При таком комплексе стр>т<турного детерминизма трудно было освоиться с представлением о специфичности полисахаридов, для многих из которых характерна статистичность структур, микрогетерогенность и, нередко, хаотичность распределения различных моносахаридных остатков по цепи. И, тем не менее, накапливающийся материал по сложному и высоко специализированному функционированию углевод ных полимеров в живых системах убеждает в том, что и в этой области возможен и необходим перевод функций- нальных свойств биополимеров на язык молекулярных структур, т. е. применим основной принцип молекулярной) [c.162]

Скорость течения жидкости (скорость элюции) можно регулировать наклоном пластины (обычно в диапазоне 5—20°). Для проявления результатов фракционирования удобнее всего воспользоваться методом снятия реплики. На влажный гель на 1 мин кладут листок толстой фильтровальной бумаги ( Whatman 3 ММ ) и прижимают его стеклянной пластиной. За это время жидкость из пространства между гранулами переходит на бумагу, а вместе с ней — и макромолекулы, находившиеся в подвижной фазе каждой хроматографической зоны. Фильтровальную бумагу затем подсушивают и пятна на ней выявляют одним из многочисленных методов окраски белков или НК, путем регистрации ферментативной активности, радиоактивности, иммунными методами и т. д. Все эти методы выявления были подробно рассмотрены при описании электрофореза и иммуноэлектрофореза [Остерман, 1981, 1983]. [c.163]

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. ДЭАЭ-целлюлозу подготавливают в соответствии с инструкцией (с. 109), заполняют колонку (3x25 см) и уравновешивают буфером (реактив № 2). Наносят раствор белка и проводят элюцию в линейном градиенте того же буфера, содержащего О—0,3 М КС1. Скорость элюции — 90 мл/ч. Собирают фракции по 9 мл, определяют в них содержание белка и ферментативную активность. Фракции, в которых обнаружена активность гексокиназы, объединяют и проводят повторную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Для этого подготавливают колонку размером 1,4X15 см. Белок элюируют буфером (реактив 2) (около 200 мл), содержащим О—0,3 М КС1. Скорость элюции — 35 мл/ч. Собирают фракции по [c.218]

На рис. 89 показаны результаты эксперимента, в котором элюцию смеси белков, включающей и цитохром-с-оксидазу, с колонки фенилсефарозы вели последовательно пятью разными детергентами. Как и следовало ожидать, цитохром-с-оксидазу снимает Тритон Х-100. Еще две зарегистрированные в опыте ферментативные активности выходят раньше, при элюции другими детергентами, а наибольшее количество сорбированного белка снимает с колонки на последнем этапе элюции ДДС-Na. Высокая эффективность ДДС-Na в качестве элюента, вероятно, связана с его относительно малой молекулярной массой. Можно предположить, что на каждый гидрофобный участок поверхности белка садится несколько молекул ДДС-Na, привнося тем самым сильно выраженную гидрофильную функцию. [c.185]

Колонкп Оксиапатита обычно предварительно промывают 5 — 10 объемами слабого ( 0,05 М) нейтрального фосфатного буфера. Если стабильность белка требует определенной ионной силы, ее обеспечивают добавлением в буфер для промывки и элюент соли. Элюцию кислых белков ведут ступенчатым или линейным градиентом концентрации фосфатного буфера — вплоть до 0,8 М. Особо прочно сорбированные белки нередко снимают пирофосфатом. Емкость колонки оксиапатита обычно составляет примерно 1—5 мг белка па 1 мл объема колонки, выход белков — 8O —100%. Утрата ферментативной активности наблюдается редко — метод относительно мягок . I По-видимому, механизм сорбции (в частности, [c.228]

При использовании белков в качестве лигандов о выборе точки закрепления в большинстве случаев не может идти речи — таких точек, как правило, на поверхности белка много. К счастью, биологическая, и в частности ферментативная, активность белка нередко сохраняется ири фиксации его в разных точках, если при этом активный центр белковой макромолекулы остается экснонированным. Разумеется, для некоторой доли молекул фермента точка связывания может оказаться в активном центре или вблизи него, что помешает взаимодействию с ним субстрата. Этим, в частности, обусловлено снижение суммарной активности при закреплении ферментов на матрицах. [c.386]

Мышечный гомогенат центрифугируют 10 мин в центрифуге с охлаждением при 12 000 g. Для инактивации глюкозофосфатизомера-зы проводят тепловую обработку. Мутный экстракт из центрифужных пробирок сливают в стеклянный стакан, доводят его pH до 5,0, добавляя по каплям 1 н. СНзСООН при постоянном перемешивании стеклянной палочкой. Проводят тепловую обработку стакан с экстрактом помещают в водяную баню, нагретую до 85—90°С, и нагревают экстракт, поддерживая указанную температуру в бане, до тех пор, пока его температура достигнет 65° (экстракт постоянно перемешивают). По окончании тепловой обработки стакан с экстрактом помещают в ледяную баню и охлаждают его до 4°С. Осадок денатурированных белков отделяют центрифугированием или фильтрованием. Центрифугат (фильтрат) хранят в рефрижераторе и используют его как источник фосфоглюкомутазы. Так как ферментативная активность сохраняется в течение нескольких недель, экстракт можно использовать при проведении повторных экспериментов. [c.60]

Молекула киназы фосфорилазы состоит из субъединиц четырех типов ар б. Молекулярная масса фермента — 1,3-10 Да — отвечает формуле (аРуб)4- Киназа фосфорилазы играет, как показано, ключевую роль в регуляции обмена гликогена и в сопряжении гликогенолиза и мышечного сокращения. В скелетной мускулатуре она существует в двух молекулярных формах нефосфорилированной ( неактивированная ) и фосфорилированной ( активированная ). Первая активна лищь при pH 8,2, вторая — при pH 6,8 и 8,2. При активации фермента отнощение активностей, измеренных при pH 6,8/8,2, возрастает от 0,05 до 0,9—1,0. Активация киназы достигается фосфорилированием а- и р-субъединиц, которое катализирует цАМФ-зависимая протеинкиназа. Каталитическую роль выполняет -субъединица б-субъединица идентична a +- вязывaющeмy белку — кальмодулину. Ферментативная активность киназы фосфорилазы полностью зависит от ионов На р-субъединице фермента имеется регуляторный центр, обладающий высоким сродством к АДФ. Константа Михаэлиса для АТФ равна [c.223]

Примечание. Так как препараты фосфоцеллюлозы отличаются между собой, целесообразно предварительно установить количество ионообменника, необходимое для связывания фермента. Берут (в расчете на сухой вес) 5 г фосфоцеллюлозы, уравновешенной буфером А, и добавляют определенную порцию раствора белка. В элюате определяют активность глюкозофосфатизомеразы. Последующие порции белка добавляют до полного насыщения ионообменника ферментом. На основе этих данных рассчитывают количество фосфоцеллюлозы, требующееся для связывания всего фермента. Суспензию перемешивают 30—40 мин, после чего в элюате определяют ферментативную активность, чтобы убедиться в полноте адсорбции фермента. [c.237]

Удаление сульфата аммония. Супернатант, полученный на предыдущей стадии, пропускают через колонку (1x21,5 см), заполненную сефадексом (3-25, уравновешенную буфером 25 мМ трис-НС1 — 30 мМ КР, pH 7,2 (пропускают примерно 150 мл). На колонку можно нанести 700—2500 единиц активности. Сразу после выхода раствора, соответствующего свободному объему колонки, в первых 4—5 мл содержится основная часть ферментативной активности. Эту фракцию белка выдерживают при О—4° С в течение 2,5 ч (происходит агрегация фермента), после чего ценгрифугируют при 30 ООО в течение 30 мин. [c.243]

Гель-хроматография. Раствор фосфофруктокиназы наносят на колонку (4x50 см), заполненную биогелем А—1,5т, предварительно уравновешенную буфером Б. Этим же буфером проводят элюцию белка с колонки. Во фракциях измеряют концентрацию белка и ферментативную активность. Фракции белка, содержащие наибольшую активность, объединяют. К объединенному раствору добавляют сульфат аммония до 557п-ного насыщения. Продолжают перемешивание в тече- [c.244]

При измерении активности на рН-метре необходимо после завершения каждого измерения определять цену деления шкалы на самописце. Для этого в кювету вносят небольшой объем (0,02—0,05 мл) титрованной НС1 (50 мМ) и фиксируют величину отскока пера самописца. 3. Ферментативную активность выражают в мкмолях окисленного НАДН за 1 мин в расчете на 1 мг белка препарата Кейлина — Хартри. [c.442]

Выделяют митохондрии из печени крысы. В кювету рН-метра наливают 4,5 мл среды измерения активности (п. 2) и погружают отмытый рН-электрод. Через 2—3 мин в кювету вносят 20—50 мкл суспензии митохондрий (2—4 мг) белка. Убеждаются в том, что нативные митохондрии не катализируют реакцию гидролиза АТФ в отсутствие разобщителя. Через 1 мин после внесения митохондрий в кювету добавляют динитрофенол до конечной концентрации, равной 0,1 мМ. Внесение разобщителя приводит к снятию трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода и активации реакции гидролиза АТФ. Измерение повторяют, в кювету после добавления митохондрий вместо динитрофенола вносят детергент тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1%- Наблюдают, как и в случае динитрофенола, стимуляцию реакции. Выбирают концентрацию тритона (в интервале от 0,02 до 2%) дегя проявления максимальной ферментативной активности. [c.460]

Каков возможный механизм инициации нервного импульса последовательностью реакций, приведенных на схеме (13-35) Проще всего предположить, что коиформационное изменение в молекуле ретиналя в процессе изомеризации 11-г Ыс-ретиналя в полностью гранс-ретиналь [схема (13-34)] индуцирует изменение конформации белка, что приводит к появлению у последнего ферментативной активности. Ферментом, инициирующим каскад химических превращений, кульминацией которых является нервный импульс, мог бы быть метародопсин П, но в пользу этого предположения нет никаких экспериментальных данных. Не исключено, что индуцированные конформационные изменения в молекуле белка открывают канал в мембране диска и какое-то вещество диффундирует по этому каналу наружу. В качестве возможного кандидата на роль указанного вещества все чаще рассматривается Са +. Расстояние от мембран дисков до плазматической мембраны палочки таково, что высвободившееся вещество успеет достичь плазматической мембраны (где и возбуждается нервный импульс) за счет диффузии. [c.66]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология